层粘连蛋白在乙肝相关性肝癌中的表达、分布及意义

王培晓，黄丽虹，张 力，陈 虹，张 庆

层粘连蛋白在乙肝相关性肝癌中的表达、分布及意义

王培晓1，2，黄丽虹3，张 力4，陈 虹2，张 庆2

目的 探讨层粘连蛋白(laminin,LN)在乙型肝炎病毒 (hepatitis Bvirus，HBV) 感染相关性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中的表达分布及意义。方法 选取2003-01至2013-05在武警总医院施行了原位肝移植手术的215例HBV相关性HCC伴肝硬化患者的组织标本，应用免疫组化的方法检测LN在肝癌组织和癌旁组织中的表达情况，并以30例正常肝组织和良性肝病组作为对照。结果 LN主要定位于HBV相关性肝癌组织肝窦窦壁，其次为癌旁间质血管与新生血管及细胞膜/浆。LN在肝癌组织中肝窦窦壁和新生血管的阳性表达率为70.23%(151/215)，在癌旁组织和良性肝病中肝窦窦壁和新生血管的阳性表达率分别为57.20%(123/215)和13.33%(3/30)，LN在癌组织中的表达显著高于其在癌旁及良性肝病中的表达(P=0.000)，LN在癌组织中的阳性表达与微卫星灶(P=0.026)、肿瘤数量(P=0.053)、血管侵犯(P=0.005)、TNM分期(P=0.029)显著相关。结论 LN的过表达可能与肝癌的发生发展及侵袭转移相关。

肝细胞肝癌；乙型肝炎病毒；LN；免疫组化

肝癌是世界上第5位常见恶性肿瘤，全球每年有近50万人死于肝癌,是近10年来发病率上升最快的肿瘤之一，其病死率位于因癌症死亡疾病的第3位[1]。中国是肝癌的高发区，约80%以上肝癌发生与慢性HBV感染有关，10%与非乙肝非丙肝性因素相关。然而，肝癌的复发率较高，进展迅速，对其发生发展机制却不十分清楚[2]。

层粘连蛋白是细胞外基质(EMC)中一种重要的蛋白质，是基底膜的重要组成部分，对维持基底膜的完整性起重要作用，且参与细胞黏附、生长、迁移和分化[3]。有研究提示LN功能结构的异常参与肿瘤细胞黏附、迁移、分化及血管形成，导致肿瘤的转移[4]。然而，对其在HBV相关性肝癌中的表达及意义的研究还较少，本研究初步探讨LN在HBV相关性肝癌中的表达分布及意义。

1 材料与方法

1.1 材料 收集2003-01至2013-05在武警总医院行原位肝移植的患者215例资料，选择蜡块保存较好且病理报告为HBV相关性肝细胞肝癌的病例进行研究，年龄15～71岁，平均(50.0±1.4)岁。手术标本经40 g/L中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，4μm厚度连续切片，进行免疫组化染色。同时随机选取5例正常肝组织(健康供肝者的肝穿标本)及25例良性肝病(酒精性肝硬化5例、布加综合征5例、肝豆状核变性5例和自身免疫性肝病5例)组织作为对照组，良性肝病为临床上确诊的病例，以同样的方法与肝癌蜡块同时进行免疫组化染色作为对照组，而且所有标记均设阳性对照并用 P B S 缓冲液代替一抗做阴性对照。一抗抗LN抗体(abcam, English, 货号ab11575)是鼠抗人多克隆抗体。购二抗为通用型kit，PV-6000 山羊抗兔/小鼠IgG/HRP聚合物(北京中杉金桥生物技术有限公司)，产品编号：PV-6000，规格为18ml装。石蜡切片机(孝感市宏业医用器械BM-VX)，电热常温干燥箱(上海一恒隔水式GHP-9080)，显微镜(OLYMPUS CX21)。

1.2 方法

1.2.1 一步法聚合物检测系统免疫组化染色 石蜡切片脱蜡水化；放入PBS缓冲液中洗涤3 min×3次，采用高温高压法进行组织修复，修复时间2.5 min；冷却降温后PBS缓冲液洗涤3 min×3次，放入3%的双氧水中10 min以除去内源性过氧化物酶；PBS缓冲液中洗涤3 min×3次，加一抗，4 ℃冰箱过夜；PBS缓冲液中洗涤3 min×5次，加二抗，37 ℃温育20 min；PBS缓冲液中洗涤3 min×5次， DAB显色，自来水冲洗, 苏木素复染, 0.1%盐酸分化, 自来水冲洗, 氨水返蓝，梯度乙醇脱水干燥, 中性树脂封片。

1.2.2 染色结果判定标准 细胞膜/质的阳性染色呈棕黄色颗粒，强度表达按阳性细胞着色强度由弱至强分别记分:无黄色颗粒样沉淀为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，深棕黄色为3分。阳性细胞百分比对应的值：将阳性的细胞数<5%算为0分，5%～25%[w5]为1分，25%～50%为2分，>50%为3分，然后将染色强度+阳性细胞百分比对应的值作为评分。>3分为阳性。窦壁及血管染色阳性以在肿瘤窦壁及血管内皮出现棕黄色颗粒为阳性。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0软件进行χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 LN在HBV相关性肝癌中的表达情况 LN主要定位于HBV相关性肝癌组织肝窦窦壁(图1A)，其次为癌旁间质血管与新生血管(图1B)及细胞膜/浆(图1C)，PBS代替一抗的阴性对照(图1D)作为对比，显示阳性染色呈棕黄色颗粒。在癌旁及良性肝病组织表达明显较低，且在非瘤组织中窦壁几乎没有染色，仅癌周边间质血管及新生血管有染色。本研究中215例HBV相关性肝癌病例中LN在肝癌组织、癌旁组织和供肝与良性肝病中肝窦窦壁和新生血管上的阳性表达率见表1，分析结果显示，LN在癌组织及癌旁中明显高于其在供肝与良性肝病的表达(P=0.000)；LN在肝癌组织、癌旁组织、供肝与良性肝病细胞膜/浆上的表达阳性率见表1，分析结果显示，LN在肝癌组织中的表达明显强于癌旁组织及供肝与良性肝病(P=0.000)，且LN在癌组织(P=0.000)、癌旁(P=0.000)中肝窦窦壁与新生血管的表达明显高于在细胞膜/浆的表达，但在供肝与良性肝病表达差异无统计学意义(表1)。

2.2 LN在肝癌肝窦窦壁及新生血管的表达与临床病理特征的相关性 肝癌组织中LN的表达与肝癌的微卫星灶(P=0.026)、血管侵犯(P=0.005)、TNM分期(P=0.029)具有明显的相关性，与肿瘤数量(P=0.053)具有相关的趋势(表2)。

2.3 LN在肝癌组织细胞膜/浆的表达与临床病理特征的相关性 肝癌组织中LN的表达与肝癌的包膜侵犯(P=0.016)有明显相关性，与血管侵犯(P=0.054)有相关趋势(表3)。

表1 LN在HBV相关性肝癌、癌旁组织及非癌组织中的表达情况

表2 LN在HBV相关性肝癌肝窦的表达情况 与临床病理特征的关系

表3 LN在HBV相关性肝癌中细胞膜/浆的表达 与临床病理特征的关系

图1 LN在HBV相关性HCC组织中阳性表达及阴性对照

A. LN在HBV相关性肝癌癌巢窦壁染色阳性(200×);B.LN在HBV相关性肝癌癌旁间质血管及新生血管阳性(200×)；C.LN在HBV相关性肝癌癌巢细胞膜/浆染色阳性(200×)；D.PBS代替一抗的阴性对照(200×)

3 讨 论

肝癌发生是多因素、多基因参与及多步骤发展的生物学过程，癌基因与抑癌基因的异常活化或抑制，最终可能引起组织细胞无节制的增殖进而形成肿瘤。肿瘤细胞的侵袭转移同样是一个复杂的生物学过程，是多阶段、多步骤、多因素、多基因综合作用的漫长过程。从癌细胞脱离母体，经过多次侵袭到转移形成，需经过两个运行周期。首先，穿过瘤体基底膜、穿过管壁基底膜进入血管或淋巴管和穿出管壁基底膜在适当部位着床，穿过这三道屏障到形成转移灶完成第1个运行周期；其次，当转移灶形成后开始第2个运行周期，基本同第1个周期直至宿主死亡。侵袭转移过程中还需要经过多次黏附才可完成[5]。LN参与细胞间基质构成，与细胞的黏附、迁移、分化与血管形成密切相关，并且有研究显示LN的表达异常，启动子低甲基化状态下的过表达与结直肠肿瘤[4,7]、神经内分泌肿瘤[6]及胃癌[7]的发生发展相关，同时也有研究显示LN功能的异常，在肿瘤组织的过表达与口腔鳞状细胞癌[8，9]及唾液腺腺样囊性癌[10]的侵袭转移有关。但LN在HBV相关性肝癌中的表达及分布情况尚无报道。

本研究显示215例HBV相关性肝癌病例中LN在肝癌组织肝窦窦壁及新生血管的表达明显强于癌旁组织及良性肝病组织(P=0.000)，在未发生癌病的肝脏组织中未观察到窦壁染色，癌旁血管多为新生的微血管染色阳性，说明LN在乙肝相关性肝癌组织的窦壁及新生血管中呈现过表达。有研究显示LN可以促进新生血管的生成及促进肿瘤的侵袭转移[12-15]，在B16F10黑色素瘤细胞中，位于层粘连蛋白α1链的长臂的SIKVAV肽，能够促进肿瘤细胞粘附、侵入和向内皮细胞的迁移，促进肿瘤细胞转移生长及肿瘤血管的生成。LNα1链球部的功能多肽AG-73(精氨酸 - 赖氨酸 - 精氨酸 - 亮氨酸 - 谷氨酰胺 - 缬氨酸 - 谷氨酰胺 - 亮氨酸 - 丝氨酸 - 异亮氨酸 - 精氨酸 - 苏氨酸;(RKRLQVQLSIRT))能够促进肿瘤细胞向血管的定位粘附与侵入。因此，笔者推测LN参与肿瘤新生血管的生成。

本研究还发现，LN的在肝癌组织表达与肝癌的微卫星灶(P=0.026)、血管侵犯(P=0.005)、TNM分期(P=0.029)具有显著的相关性，提示LN可能与肝癌微卫星灶形成及血管侵犯的发生有关。进一步推测LNα1可能参与促进肝癌的侵袭转移。

另外，本研究显示LN在肝癌组织细胞膜/浆的表达明显强于在癌旁组织及良性肝病组织的表达(P=0.000)，说明LN在乙肝相关性肝癌组织的细胞膜/浆中也呈现过表达。梅文忠等[11]对胶质瘤的研究显示：LN主要定位于细胞膜上，LN在细胞膜的表达可能促进癌细胞之间或癌细胞与 ECM 、 血管基膜之间的黏附和迁移。另有研究发现[12]，LN在与其他因素协同作用下能够促进人肝细胞的增殖，如黏附因子黏合素，在缺少该因素的情况下，肝细胞的存活、增殖显著降低。LN还可以在促进增殖的同时导致细胞去分化和异常分化。肿瘤细胞表面还表达层黏连蛋白的受体LN-R，为肿瘤细胞的黏附、侵袭和转移提供了分子基础。同时肿瘤细胞自身也可以分泌层粘连蛋白，促进其黏附侵袭和迁移。本研究中LN在肝癌组织细胞膜/质有29.77%的阳性表达，与肝癌的包膜侵犯(P=0.016)有显著相关性，与血管侵犯(P=0.054)有相关趋势。推测其参与该机制促进肝癌的侵袭和迁移。但LAMA1基因在癌组织(P=0.000)、癌旁(P=0.000)中肝窦窦壁与新生血管的表达明显高于在细胞膜/质的表达，在良性肝病中的表达差异无统计学意义，表明LN在肝癌组织窦壁与新生血管的表达比在细胞膜/浆的表达更有意义。

综上所述，LN在窦壁及新生血管壁上的过表达与血管侵犯、微卫星灶、肿瘤数量及TNM分期具有明显的相关性，推测LN可能参与促进肿瘤新生血管的生成并与肝癌的发生发展及侵袭转移有关。但其具体机制还不清楚，需要进一步的研究。

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(2015-05-20收稿 2015-06-20修回)

(责任编辑 梁秋野)

The distribution and the significance of laminin gene expression in hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma

WANG Peixiao1,2, HUANG Lihong3, ZHANG Li4, CHEN Hong2, and ZHANG Qing2.

1.Institute of Organ Transplantation, 3.The graduate student affairs office，General Hospital of Chinese People’s Armed Police Force, Beijing100039,China；2. Graduate Division of Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003,China；4.First Department of Surgery; Shaanxi Provincial Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Force, Xi’an 710054, China

Objective Investigated the expression of laminin gene in hepatitis B induced-hepatocellular carcinoma(HCC), both of the specificity of the expression. Method Objects were 215 patients of HBV induced-HCCwith cirrhosis in our hospital who had been in the liver transplantation operation from 2003/1 to 2013/5. We examined the expression of laminin in 215 cases of HCC and adjacent tissues by immunohistochemistry.As the normal controls were normal liver tissue and benign liver disease. Results Localization of laminin on hepatic sinusoidal endothelial cell (SEC) and neovascularization of the stromal tissue and membrane / plasma. The expression of the laminin postive on hepatic sinusoidal endothelial cell and neovascularization of the HCC tissues was 70.23%(151/215), with 57.20%(123/215) in cancer adjacent tissues，with 13.33%(3/30)in benign liver diseases tissues. The expression of laminin protein in tumour tissues was significantly higher than that in cancer adjacent tissues and benign liver diseases tissues (P=0.000). By clinicopathologic rank correlation analysis， the expression of laminin was associated with tumour microsatellite focal(P=0.026) ,tumor number(P=0.053) , vascular invasion(P=0.005)andTNM(P=0.029). Conclusion laminin expression at the protein levels was also observed in association with developing and metastasisof the hepatocellular carcinoma.

hepatocellular carcinoma;laminin; Immunohistochemistry；HBV

首都临床特色应用研究项目(Z121107001012168)、国家自然科学基金项目(81372595)

王培晓，硕士研究生，E-mail:zqy47@sina.com

100039 北京，武警总医院：1.肝移植科，3.研究生办；2.453003，新乡医学院；4.710054 西安，武警陕西总队医院普通外科

张 庆,E-mail:xiao.1015.y@qq.com

R730.231