成纤维细胞生长因子信号通路与小鼠肺发育

夏 天，林仙花，唐业东，胡雪峰

（福建师范大学生命科学学院，福建省发育与神经生物学实验室，福建福州350108）

成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factors，FGFs）是1973年Armelin首次从小鼠脑垂体提取液中纯化分离出的一种广泛存在于脊椎动物和无脊椎动物体内与发育相关的信号分子。至今已发现23个家族成员，其同源性酪氨酸激酶蛋白受体分为4种类型，配体与受体相结合，激活3条下游信号途径参与调控细胞增殖、迁移和分化。FGFs信号在组织器官发育和修复、组织稳态和新陈代谢过程中具有多样性效应，在小鼠肺上皮和间质相互调控网络中具有诱导肺芽萌发，促进细胞增殖分化，调节肺分支形态建成的作用。近年越来越多研究表明，不同FGFs的表达异常可引起多种相关肺疾病，如肺癌、慢性阻塞性肺疾病、纤维化等［1］。

1 FGFs信号通路简介

1.1 FGFs

FGFs是一类由150个～200个氨基酸构成的多肽物质，具有广泛促有丝分裂的细胞内活性，并参与多种生物生命活动过程，包括细胞生长、胚胎发育、形态发生、组织修复、肿瘤生长和入侵。目前已经发现的FGF家族至少包括23个成员，Fgf1～Fgf23，成员之间具有25%～50%的相同氨基酸序列，中心区域氨基酸序列存在高度同源性的硫酸乙酰肝素结合域，折叠成12条逆向平行的β链，又进一步形成圆柱状结构。

FGFs分泌蛋白配体可分为旁分泌型和内分泌型，FGF1－FGF18、FGF20、FGF22 属 于 旁 分 泌，FGF19、FGF21、FGF23属于内分泌［2］。旁分泌FGFs比内分泌FGFs对硫酰乙酰肝素表现出更高的亲和力，因此固定在邻近分泌位点的细胞周围和细胞外基质上，只在相同器官的细胞中发挥作用。相反，因为与硫酸乙酰肝素亲和力差，内分泌FGFs从分泌它们的细胞中自由扩散，进入血液循环到达远处器官的靶细胞发挥作用。旁分泌FGFs需要硫酸乙酰肝素作为激活受体的辅因子，而内分泌依赖Klotho协同受体激活受体［3］。胚胎发育中，旁分泌FGFs在每一步都发挥重要作用，包括生殖细胞层的诱导和模式，体轴形成，器官发生和形态发生的诱导和组织模式［4－5］；内分泌FGFs调节多种新陈代谢过程，包括磷酸化，葡萄糖和脂类代谢。

1.2 成纤维细胞生长因子受体

成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factor recepter，FGFRs）信号典型蛋白结构由3个胞外免疫球蛋白域（D1～D3），1个单向跨膜域和1个细胞内酪氨酸激酶域组成。酪氨酸激酶型受体与配体结合后发生二聚体化，偶联受体亚基细胞间发生磷酸化以活化FGFR信号途径。

1.3 FGFs信号转导途径

FGF配体诱发受体二聚化，引导细胞内受体激酶域以正确的距离和方向转移磷酸根，接着激活受体激酶。活化的受体激酶转而磷酸化并激活细胞内底物，FGFR激酶主要底物是FGFR底物2α（FRS2α）和磷脂酶Cγ1（PLCγ1），它们在结构上与受体激酶连接。研究发现，FGFR 激酶引导3 条信号传导途径：MAPKK／MAPK kinase 途 径；BAX／BCL－2－associated X protein途径；PDK／phosphoinositide－dependent protein kinase途径［6］。

1.3.1 MAPKK／MAPK kinase途径 FGFR底物2α（FRS2α）被 激 活 后 与 生 长 因 子 连 接 蛋 白（receptorbound 2GRB2）结合，GRB2 招 募（guanine nucleotide exchange factor son of sevenless，SOS），接着SOS激活RAS GTPase起始MARK 级联反应，激活的MAPK从细胞质转到细胞核，并在细胞核内磷酸化，立即激活早期基因转录。这条通路的主要结果是细胞增殖，但也可导致细胞分化，细胞迁移或者引起另一个细胞发生反应。

1.3.2 BAX／BCL－2－associated X protein 途 径FRS2α激活后与GRB2协同结合蛋白1（adaptor protein GRB2－associated binging protein 1，GAB1）结合形成信号复合物。而招募的GAB1以PI3K－AKT 通路调节下游信号，PI3K 介导PDK 激活AKT酶（protein kinase B）表达，抑制促细胞凋亡反应器从而保证细胞活性，如细胞死亡的拮抗物BCL－2（BAD）和叉头转录因子O型（forkhead box class O，FOXO）头转录。

1.3.3 PDK／phosphoinositide－dependent protein kinase途径 FGFR激酶招募PLCγ1并将其磷酸化，起始一条独特信号通路，在细胞迁移和细胞分化中起作用，并对RAS－MAPK 和PI3K－AKT 途径产生影响。活化的PLCγ1催化磷脂膜的磷脂酰磷酸肌醇4，5－二磷酸（PtdIns（4，5）（P2）水解为二酰甘油（DAG）和肌糖－1，4，5－三磷酸肌醇（IP3）8。DAG 激活蛋白酶C（PKC），以磷酸化方式依次激活它的底物，包括富含甘氨酸的十八烷基化激酶C底物（myristoylated Alarich C kinase substrate，MARCKS），MARCKS是细胞活性调节物质；IP3刺激胞内储存的Ca2＋离子释放，触发Ca2＋依赖蛋白（如钙调磷酸酶）激活，Ca2＋依赖蛋白激活后诱导激活的T 细胞转录因子核因子（NFAT）在核内转运，刺激对细胞活性至关重要的蛋白表达［7］。

2 FGFs信号通路在小鼠肺发育中的作用

2.1 小鼠肺发育过程

小鼠肺器官发育过程包括：①假腺期（胚胎龄9.5d～16.5d（E9.5－E16.5），原肠胚（上皮层）诱导侵入周围内脏中胚层（间充质），间皮重叠并建立肺原基，E9.5形成气管和各级支气管，E10.5－E16.5细支气管再分支成短管束，呼吸树形成；②微管期（E16.6－E17.4），呼吸树朝直径和长度扩展，毛细血管在肺腺泡生成后整合入肺泡上皮细胞之间开始构成管道网络系统；③囊状期（E17.5－P5），未来呼吸区域的末端导管形成外周呼吸道，此阶段末期的胎肺可以支持早熟胎儿肺部气体交换；④泡状期（P6－P30），毛细血管网络和肺泡为准备气体交换而进行重建，肺泡数量和表面积显著增多。整个肺分支形态是由上皮和间质层相互作用形成的，肺芽经历萌发，生长和最终分支3个阶段，在分支点连续重复着这套循环，构建起肺呼吸道复杂的树样结构，最终形成成熟的肺［8］。

2.2 FGFs在小鼠肺发育中的作用

已有研究表明，Fgf1、Fgf2、Fgf7、Fgf8、Fgf9、Fgf10和Fgf18在小鼠肺发育过程中发挥重要作用，包括肺芽萌发，促进细胞增殖分化，诱导肺分支形态建成等。Fgf1在假腺肺早期小鼠胚胎肺上皮和肺泡巨噬细胞中表达，对于肺上皮萌发肺芽过程中发挥重要作用，是所有FGFRs的高度亲和性配体，主要依赖酪氨酸激酶受体Ras－Raf－MEK－MAP 激酶－转录调节通路介导细胞外信号，从而调节肺的形态建成。Fgf1参与肺部病理修复过程，当肺部损伤后肺泡上皮细胞和巨噬细胞内表达Fgf1；实验性诱导的肺纤维化过程中，Fgf1开始表达，通过MEK－ERK 诱导Smad2去磷酸化引起胶原合成增加（胶原酶合成减少），EMT（Epithelial－mesenchymal transition）下调和肌成纤维细胞积累，成功抵抗TGF－β引起的肺部纤维化并缓解了肺功能紊乱。Fgf2在肺上皮支气管平滑肌细胞中表达，可有效诱导肺上皮细胞特定表面活性蛋白（SP－A，－B和－C）的表达，是肺上皮细胞特异表面活性蛋白表达最有效的诱导剂。Fgf2可加强肺部组织上皮细胞增殖，从而修复损坏的肺部组织，因此Fgf2基因修饰的间充质干细胞已经成为治疗缓解肺组织损伤的高效基因修饰载体［9］。然而Fgf2也可介导MAPK信号通路促进肌成纤维细胞增殖，导致肺纤维致密化。Ju W等［10］研究发现，如果阻断FGF2／FGFR通路便可有效减轻肺纤维化程度。蔡宏凤等［11］在治疗肺癌的研究过程中发现，上皮间质转化是肿瘤浸润转移的重要机制之一，而阻断fgf2信号通路在诱导肺癌细胞A549上皮间质转化过程中发挥的作用，则可能改善肺癌浸润和转移的效应，为治疗肺癌提供更好的方法。Fgf7在小鼠假腺肺早期和微管肺早期肺上皮有强烈表达，结合受体经MAPK信号传导途径完成一系列的级联反应，发挥生物学效应［12］。Fgf7具有促进远端呼吸道上皮细胞分化并形成囊样结构的作用。Fgf7能有效诱导Erm 和Pea3表达，从而调控成体肺上皮细胞的分化过程（E11.5 时Erm 特异在肺上皮表达，而Pea3在肺上皮和间质中均表达），促进驱动肺泡上皮细胞成熟Ⅰ型Ⅱ型分化和特性表达。Fgf7预处理小鼠可有效缓解酸、高氧、辐射等因素导致的肺组织损伤，同时，损伤肺组织中Fgf7的表达量有显著提高，推断出Fgf7对肺损伤具有较好的保护及修复作用［13］。

小鼠胚胎E12.5初次检测到Fgf8mRNA 转录，在肺间质和肺上皮中均可表达，是调控肺胚胎阶段过程中细胞增殖所必需的生长因子，能够维持胚胎肺发育并引导产后肺泡的发生。Fgf8突变小鼠远端肺I型上皮细胞较少，由于内衬肺泡壁细胞持久表达Nkx2.1，引起肺II型上皮细胞异常增殖，从而抑制肺泡化过程。研究表明，Fgf8缺失小鼠的肺上皮和间充质从E16.5～E18.5将会出现明显的过度增殖，引起肺上皮细胞分化被阻断，血管重塑异常［14］。

FGF9通过Fgfr2IIIc参与调节肺分支形态的建成。E10.5，Fgf9在肺芽外缘的肺胸膜和支气管上皮表达，但在随后的E12.5和E14.5，肺胸膜持续表达Fgf9，但在上皮位置已经检测不到Fgf9的存在。研究表明，Fgf9对于促进肺间质细胞的增殖具有重要的作用。Fgf9－／－小鼠胚胎肺间质发育不良以至于到妊娠末期难以维系生命［15］。

Fgf10在小鼠肺外周间充质组织以及间充质包裹着正在发育的肺上皮远侧尖端中表达，在肺器官发育过程中肺芽形成、远端间质细胞分化过程中发挥着重要作用。Fgf10缺陷小鼠会因缺乏下游气管、主要支气管和肺实质，导致小鼠死亡。Fgf10是Fgfr2b的主要配体，而Fgfr2b是早期肺气管发育上皮间充质相互作用的关键，抑制FGFR2信号可导致肺气肿疾病或肺器官发育不良症状。Fgf10在参与调节肺分支形态时，与其他信号通路因子相作用，如TGF－β（transforming growth factors－β）信号通路。研究发现，TGF－β信号通路可以抑制Fgf10的表达从而调节成体肺上皮干细胞的生长［16］。FGF10通过K－RAS基因调控肺发育过程，Fgf10在肺Ⅱ型上皮细胞过表达使其下游RAS－MAPK信号通路过度打开，从而导致肺腺瘤样组织增生，为肺部相关肿瘤疾病的治疗提供了一定理论支持［17］。

Fgf18在胚胎和产后肺中显著性表达，在肺近端呼吸道软骨管和周围间充质中表达，具有刺激肺间充质细胞和上皮细胞增殖，抑制远端肺泡形成的作用。Fgf18的表达时间和模式不同于Fgf9或Fgf10，在胎儿期3d～10d具有高通量表达，表达出来的蛋白可结合Fgfr1亚型以外的多种FGFRs，其功能可能与Fgf7（结合并激活Fgfr2IIIb）和Fgf10（结合Fgfr2IIIB和Fgfr1IIIB亚型）重叠。Fgf18和Fgf8是在肺上皮表达密切相关，但Fgf18缺失小鼠报告表型与Fgf8截然不同：Fgf18基因缺失突变小鼠体型偏小发育不良，肺形态较小，近远端呼吸道受损，气泡空间缩减，细胞增殖减少，然而Fgf8突变体表型远端上皮增生，间质过度增殖，远端上皮分化紊乱。Takahashi H 用除草酚诱导肺纤维化，提出Fgf18在微管肺阶段和囊状肺时期表达的下调可能干扰肺囊状－泡状分化以及远端呼吸道的成熟从而导致肺发育不良，也证明了Fgf18对肺发育的重要性［18］。

2.3 FGFRs在小鼠肺发育中的作用

FGFRs信号在肺上皮分支形态发生，远端细支气管分化和胎肺血管生成中起着重要作用。在胚胎发育阶段，Fgfr1在气管和肺芽间充质中都有表达。而Fgfr2在肺胚胎早期上皮区域全部都能检测到，之后其表达只局限于远端上皮区。Fgfr3和Fgfr4在远端上皮低水平表达。缺乏Fgfr3和Fgfr4的小鼠突变体没有经历正常的肺泡化，但在出生后如果立即抑制FGFR信号，则不能改变出生后小鼠的肺泡化。FGFRs表达量扩增则可导致肺鳞状细胞癌（Squamous cell lung carcinoma，SCC）发生［19］。其中FGFR1 扩增是肺鳞癌中最常见的一种可治疗性基因损伤，因为FGFR级联在肿瘤细胞增殖，血管生成，移植和存活中扮演重要作用，而FGFR 抑制剂在多种活体／离体肿瘤模型中可以减少细胞增殖，诱导细胞死亡，所以将FGFR1标准化报告与FGFR1抑制剂相结合对肺鳞癌的临床治疗具有重要意义［20］。哺乳动物衰老过程中，体内氧化应激损伤等会导致成纤维细胞和肺上皮细胞功能异常以及修复能力受损，进而导致肺组织结构发生变化，如特发性肺纤维化。李小溪等研究发现，8月龄的小鼠肺组织的纤维化倾向比5周龄的小鼠更加明显，可证明小鼠肺组织的纤维化进程可能与衰老相关，FGFs／FGFR 系统活性下降，证明FGFRs不仅能促进肺组织发育，还在肺组织的纤维化／损伤修复中起着不可或缺的作用，据此，FGFRs相关分子药物可能是未来治疗肺纤维化疾病的关键［21］。

3 小结

FGFs配体与受体相互协调共同控制肺的发育，对小鼠肺芽萌发，促进细胞增殖分化，诱导肺分支形态建成等方面都发挥着关键作用。肺间质细胞的分化也逐渐引起人们关注，不同类型的间质细胞群构成成体肺中不同位置的干细胞龛，释放激活或抑制干细胞的重要信号［22］。而肺相关疾病的产生，可能就是由于相关FGFs表达异常，造成干细胞龛的稳态发生破坏而引起的。

此外，FGFs与其他信号通路BMPs，WNTs 以及Hedgehogs在肺部相互作用机制大多还不清楚，FGFs信号特异性转导的分子机制仍然需要进一步探索，比如FGFR激酶在配体－受体二聚体过程中转磷酸化的速度、程度和持续时间由什么决定，又是怎样导致不同信号的产生？解决这些问题不仅利于我们理解FGFs在极其多样化的生物环境中怎样生成和运输，还为进一步阐明肺器官发育的分子机制奠定基础。

［1］ 周建华.FGF－2抑制小细胞肺癌凋亡机制探讨［D］.湖南长沙：中南大学生命科学学院，2007.

［2］ Asada M，Shinomiya M，Suzuki M，et al.Glycosaminoglycan affinity of the complete fibroblast growth factor family［J］.Biochem Biophys Acta，2009，1790（1）：40－48.

［3］ Ding X，Boney－Montoya J，Owen B M，et al.Beta Klotho is required for fibroblast growth factor 21effects on growth and metabolism［J］.Cell Metab，2012，16（3）：387－393.

［4］ Itoh N，Ornitz D M.Fibroblast growth factors：from molecular evolution to roles in development，metabolism and disease［J］.J Biochem，2011，149（2）：121－130.

［5］ Dorey K，Amaya E.FGF signalling：diverse roles during early vertebrate embryogenesis［J］.Development，2010，137（22）：3731－3742.

［6］ Gotoh N.Regulation of growth factor signaling by FRS2family docking／scaffold adaptor proteins［J］.Cancer Sci，2008，99（7）：1319－1325.

［7］ Li H，Rao A，Hogan P G.Interaction of calcineurin with substrates and targeting proteins［J］.Trends Cell Biol，2011，21（2）：91－103.

［8］ Kim H Y，Nelson C M.Extracellular matrix and cytoskeletal dynamics during branching morphogenesis［J］.Organogenesis，2012，8（2）：56－64.

［9］ Zhao Y F，Luo Y M，Xiong W，et al.Mesenchymal stem cellbased FGF2gene therapy for acute lung injury induced by lipopolysaccharide in mice［J］.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2015，19（5）：857－865.

［10］ Ju W，Zhihong Y，Zhiyou Z，et al.Inhibition of alpha－SMA by the ectodomain of FGFR2cattenuates lung fibrosis［J］.Mol Med，2012，18：992－1002.doi：10.2119／molmed.2011.00425.

［11］ 蔡宏凤，王慎旭，卢媛媛，等.bFGF诱导肺腺癌细胞系A549上皮间质转化［J］.现代生物医学进展，2012，12（7）：1241－1243.

［12］ Ceccarelli S，Romano F，Angeloni A，et al.Potential dual role of KGF／KGFR as a target option in novel therapeutic strategies for the treatment of cancers and mucosal damages［J］.Expert Opin Ther Targets，2012，16（4）：377－393.

［13］ Li X，Li S，Zhang M，et al.Protective effects of a bacterially expressed NIF－KGF fusion protein against bleomycin－induced acute lung injury in mice［J］.Acta Biochem Biophys Sin，2010，42（8）：548－557.

［14］ Yu S，Poe B，Schwarz M，et al.Fetal and postnatal lung defects reveal a novel and required role for Fgf8in lung development［J］.Dev Biol，2010，347（1）：92－108.

［15］ Yin Y，Wang F，Ornitz D M.Mesothelial－and epithelial－derived FGF9have distinct functions in the regulation of lung development［J］.Development，2011，138（15）：3169－177.

［16］ McQualter J L，McCarty R C，Van der Velden J，et al.TGF－beta signaling in stromal cells acts upstream of FGF－10to regulate epithelial stem cell growth in the adult lung［J］.Stem Cell Res，2013，11（3）：1222－1233.

［17］ 李小兵.FGF10通过K－RAS调控小鼠肺发育的分子机制［D］.福建福州：福建师范大学生命科学学院，2013.

［18］ Takahashi H，Friedmacher F，Fujiwara N，et al.Pulmonary FGF－18gene expression is downregulated during the canalicularsaccular stages in nitrofen－induced hypoplastic lungs［J］.Pediatr Surg Int，2013，29（11）：1199－1203.

［19］ Lam S K，Li Y，Zheng C，et al.Combination effect of arsenic trioxide and FGFR inhibitor through downregulation of FGFR，Akt and Erk in squamous cell lung carcinoma［C］.HongKong Med J，2014.

［20］ Schildhaus H U，Heukamp L C，Merkelbach－Bruse S，et al.Definition of a fluorescence in－situ hybridization score identifies highand low－level FGFR1amplification types in squamous cell lung cancer［J］.Mod Pathol，2012，25（11）：1473－1480.

［21］ 李小溪，常红恩，奈文青，等.成纤维细胞生长因子受体各亚型与小鼠肺纤维化及衰老的关系［J］.南方医科大学学报，2013，33（4）：607－610.

［22］ Volckaert T，De Langhe S P.Wnt and FGF mediated epithelialmesenchymal crosstalk during lung development［J］.Dev Dyn，2015，244（3）：342－366.