小反刍兽疫基因工程疫苗研究进展

曹冬伸，赵柏林，曲 萍，胡冬梅，王文超，宋晓晖＊，潘树德＊

（1.沈阳农业大学，辽宁沈阳110866；2.中国动物疫病预防控制中心，北京102609）

小反刍兽疫（Peste des petits ruminants，PPR）俗称“羊瘟”，是由小反刍兽疫病毒（Peste des petits ruminants virus，PPRV）引起山羊、绵羊及野生小反刍动物发生的以发热、口炎、腹泻、肺炎为特征的急性接触性传染病。世界动物卫生组织（OIE）曾将其列为必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。1942年，Dennec G 等首次报道了非洲西部象牙海岸发生的PPR 疫情。此后，PPR 几乎遍及撒哈拉沙漠到赤道的所有国家。近年来，PPR 全球疫情趋于复杂，老挝、孟加拉国、印度、尼泊尔、俄罗斯、巴基斯坦和缅甸等我国周边多个国家该病呈地方性流行态势。2007年PPR 首次由境外传入我国西藏阿里地区［1］，疫情很快被迅速扑灭，之后在2008年和2010年再次由境外传入并引发疫情。2013 年底，PPR 由境外传入我国新疆地区，之后迅速蔓延至全国多个省份。

目前，PPR 防控主要以弱毒疫苗免疫为主。1980年，研究人员通过将Nigeria 75／1 分离株在Vero细胞上连续传代成功获得了PPRV 致弱毒株，之后在此基础上制成了第一株PPRV 弱毒疫苗。基于Nigeria 75／1的致弱株疫苗目前仍在非洲地区广泛使用，由于亚洲国家境内流行的病毒谱系均为IV 系，接种Nigeria 75／1弱毒疫苗后可能会增加各谱系病毒的重组、突变和毒力增强的几率，因此，印度研究人员使用基因IV 分离株Sungri／96、Arasur／87、Coimbatore／97 等，在Vero 细 胞 上 传 代 致弱研制成了3株PPRV 弱毒疫苗，该疫苗目前在印度广泛使用。弱毒疫苗的应用在PPR 疫病控制中发挥了重要作用，但由于产生的抗体无法同野毒感染抗体区分，给疫病的监测和净化工作带来了困难。因此开发新型基因工程苗成为近年来的研究热点，并且在重组亚单位疫苗、病毒样颗粒疫苗、反向遗传致弱活疫苗、核酸疫苗等研究领域均取得了一定的进展。

1 亚单位疫苗

亚单位疫苗是指以能诱导机体产生抗体的病原体功能性结构蛋白制成的疫苗。亚单位疫苗不含病毒基因，因此具有安全性高、方便规模制造等优点，是目前开发新型疫苗的一个重要手段。PPRV 是单股负链RNA 病毒，同其他麻疹病毒科成员一样，具有囊膜，病毒基因组共编码6种结构蛋白，分别为核衣壳蛋白（N）、磷蛋白（P）、大蛋白（L）、囊膜基质蛋白（M）、纤突糖蛋白（F）和血凝素（H）。目前在这些结构蛋白的功能研究方面都取得了一些进展。N 蛋白包裹着病毒RNA，是最主要的免疫原蛋白，但是针对N 蛋白的抗体，并不能抵抗病毒感染，因此该蛋白主要用于诊断试剂的研究；H 蛋白是血凝素蛋白，能够结合宿主细胞表面的受体，启动膜融合，使病毒基因组进入细胞中，H 蛋白是PPRV 感染的最主要免疫原性蛋白，也是引起体液免疫的主要蛋白；F蛋白主要引起细胞免疫。目前PPR 亚单位疫苗的研究主要集中于H 蛋白和F蛋白，已经成功构建了能够表达H 蛋白、F 蛋白以及F 和H 蛋白的羊痘病毒、腺病毒、杆状病毒等重组病毒，在实验条件下接种动物，能够诱导接种动物产生免疫保护力并且没有副作用。

Diallo A 等［2］将PPRV 的H 基 因 和F 基 因 整合到山羊痘病毒（CPV）上获得表达PPRV H 蛋白和F 蛋白的重组CPV 疫苗，该类疫苗免疫接种羊群可以有效保护羊群免受PPRV 和CPV 的感染，并且低PFU 剂量接种也可产生针对PPRV 的完全保护。Caufour P等［3］以CPV－Kenya sheep－1（KS－1）为基础成功构建了表达PPRV－Nigeria 75／1毒株的F蛋白和H 蛋白的重组CPV，将这两株重组病毒以103TCID50／头份的剂量接种山羊，可使山羊获得针对CPV 和PPRV 的免疫保护力，免疫保护可持续3周时间。Qin J L 等［4］将包含人巨细胞病毒（hCMV）启动子和BGH 早期mRNA 的多聚腺苷酸化信号的PPRV H 蛋白表达系统插入到犬2型腺病毒非复制关键区的E3区的SSPI的位点，构建了表达PPRV H 蛋白的重组犬2型腺病毒，用该重组犬2型腺病毒免疫接种山羊可产生高水平的免疫抗体，抗体水平可持续长达7个月的时间，并且在免疫接种山羊体内没有分离出腺病毒。Wang Y等［5－6］分 别 以 腺 病 毒（AV）为 载 体，构 建 了 表 达PPRV 的F蛋白、H 蛋白以及F－H 融合蛋白的重组腺病毒疫苗，以该重组病毒免疫接种绵羊或山羊，可使受免疫动物产生有效的抗病毒中和抗体，并且没有出现临床副反应。Rojas J M 等［7］发现用同时表达PPRV F和H 的重组腺病毒疫苗免疫效果比用只表达F蛋白或H 蛋白的重组腺病毒的好，免疫保护可持续长达21周，并且可以同时激活机体的细胞免疫和体液免疫。Rahman M M 等［8］以家蚕角体病毒（BmNPV）表达系统表达PPRV 的F蛋白和牛瘟病毒（RPV）H 蛋白融合蛋白，免疫接种小鼠后，小鼠能够产生针对PPRV 和RPV 的特异性抗体。

目前研制成功的PPRV 亚单位疫苗主要分为PPRV H 蛋白亚单位疫苗和PPRV F－H 融合蛋白亚单位疫苗，该两种亚单位疫苗在临床上均可完全保护羊群不受PPRV 的感染，又因其不含有PPRV的全基因组，因此该亚单位疫苗具有免疫保护性强，安全性高，并可通过血清学检测免疫羊群是否感染PPRV 野毒等优点。但因其在机体内产生的高水平抗体时间为2个～7个月，故此类抗体在有效保护时间上存在一定缺陷。

2 病毒样颗粒疫苗

病毒样颗粒（virus－like particle，VLP）是一种空心颗粒或包膜状颗粒结构，由病毒结构蛋白组装而成，形态上与真正病毒粒子相似，因缺乏病毒基因组而不能自主复制。与单独的抗原蛋白和多肽相比较，病毒样颗粒表现出与天然病毒更相似的构象表位，以接近真实构象的形式呈递给免疫细胞，更容易被机体免疫系统识别，从而有效诱导机体产生免疫保护反应，因此具有更强的免疫原性和生物学活性，并且不存在基因重组或重配和毒力返强的可能，安全性高，是安全的候选疫苗。Tiollais M L等［9］成功开发出第一个基于VLP的疫苗－乙肝病毒表面抗原VLP（HBsAg）疫苗，自此病毒样颗粒疫苗的研究迅速发展。目前已经建立了细菌、酵母、杆状病毒／昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞等基于不同表达系统的病毒样颗粒系统，并且已经成功包装出了艾滋病病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、传染性法氏囊病病毒、蓝舌病病毒等病毒的病毒样颗粒［10］。

王秋霞等［11］构建了表达PPRV 4 个结构蛋白的 真 核 表 达 载 体 pCAGGS／N、pCAGGS／M、pCAGGS／F 和pCAGGS／H，将这4个重组质粒共转染Vero细胞，成功装配释放了PPRV VLP，研究还发现M 蛋白是PPRV VLP正确的装配和释放所必须的。随 后 刘 拂 晓 等［12－15］利 用Bac－to－Bac○R杆 状病毒表达系统成功构建了共表达M 和H 蛋白的病毒BV－MH 和共表达M、H、N 蛋白的病毒BVMHN，通过Western blot、透射电镜等技术证明这两种重组病毒在昆虫细胞中均可表达相应的蛋白并自行组装成VLP（VLP－MH、VLP－MHN），并以出芽方式释放。将VLP－MH、VLP－MHN 通过蔗糖密度梯度离心提纯后免疫小鼠发现，这两种VLP均可诱导小鼠产生特异性抗H、N 蛋白抗体和中和性抗体，但VLP并不能诱导小鼠产生干扰素和白细胞介素。Li W C等［16］利用杆状病毒表达系统成功构建了包含PPRV M 蛋白、F 蛋白、H 蛋白的VLPs，用构建的VLPs皮下免疫接种山羊和小鼠后，山羊和小鼠体内针对PPRV 的IgG 抗体显著升高，在4周内能够获得针对PPRV 的完全免疫保护。

PPRV 病毒样颗粒疫苗，在抗原形态上表现为抗原蛋白与病毒颗粒保持一致，因此其具有完整PPRV 的免疫原性，又因其不含病毒基因组，故该疫苗较弱毒活疫苗具有安全性高，可通过血清学检测免疫羊群是否感染PPRV 野毒等优点。但因其在机体内不能连续产生病毒样颗粒，使得该疫苗在保护周期上表现出一定的短板。

3 反向遗传致弱活疫苗

反向遗传致弱活疫苗是指以反向遗传技术对病毒的基因组进行定向改变，然后通过病毒拯救技术得到病毒基因突变或缺失的毒株，并用其制备疫苗。该疫苗兼具弱毒苗的优点，且目的性更明确，减毒效率更高，毒力恢复的几率更小，是目前发展迅速的新型疫苗研究方向。1981 年，Racaniello等利用克隆的脊髓灰质炎病毒全长cDNA 转染哺乳动物细胞首次成功的拯救了脊髓灰质炎病毒，开创RNA 病毒反向遗传学研究的先河。随着反向遗传操作技术的兴起和发展，30 多年来，几乎针对所有重要的RNA 病毒，如口蹄疫病毒、流感病毒等都成功建立了相应的反向遗传操作系统，通过构建RNA 病毒的感染性cDNA，在DNA 水平上进行体外操作，将病毒基因组中的毒力基因进行敲除或者替换，就可以获得毒力减弱的疫苗株，为研究和开发RNA 病毒疫苗提供了新思路和新手段。

Radecke L S等［17］利用T7RNA 聚合酶系统首次成功建立了麻疹病毒（Measles virus，MV）反向遗传操作系统，随后麻疹病毒属其他成员的反向遗传操作系统也相继被建立起来，目前成功构建了MV、RPV、CDV、PPRV 等病毒的反向遗传操作系统［18］。对于PPRV 反向遗传操作系统建立的关键步骤是病毒基因组全长cDNA 的克隆，目前多采用“分段克隆”的方法，即将PPRV 病毒全基因分片段克隆，并将得到的病毒基因片段通过双酶切连接到真核表达载体上，测序并确定序列正确后通过共转染细胞成功拯救出病毒。Hu Q 等［19］通过该方法成功构建了PPRV 的反向遗传系统，并成功拯救获得了能表达绿色荧光蛋白（eGFP）的Nigeria 75／1 毒株。此后Yin C 等［20］还利用该系统成功构建了表达口蹄疫病毒（FMDV）VP1 蛋白的PPRV 重组病毒，该重组病毒可在体外正常增殖，并且能够表达口蹄疫病毒VP1 蛋白。重组病毒诱导山羊产生PPRV 中和抗体的免疫原性也没受到影响，免疫山羊后可同时检测到针对FMDV 和PPRV 的中和抗体，攻毒试验表明该疫苗可完全保护山羊免受FMDV 野毒和PPRV 野 毒 的 攻 击。Muniraju M 等［21］成功构建了PPRV 病毒的反向遗传操作系统，并成功拯救出H 蛋白77位半胱氨酸定点突变的Nigeria75／1毒株的弱毒株，以该毒株为疫苗接种羊群，羊群可获得针对PPRV 的完全保护，并可通过竞争ELISA 方法区别疫苗毒和野毒。

PPRV 反向遗传致弱活疫苗利用病毒反向遗传技术，构建PPRV 拯救平台，通过该平台可成功拯救由基因突变或缺失致弱的PPRV，并可将该弱毒制作弱毒活疫苗。由该方法制备的PPRV 弱毒活疫苗从基因水平解决了弱毒活疫苗在动物机体内的弱毒返强问题。同时该方法还可根据不同基因型的PPRV 制备相应PPRV 反向遗传致弱活疫苗。该疫苗有效的解决了弱毒活疫苗的安全性问题，同时保留了弱毒活疫苗的全部优点，更为突出的优点是可针对基因突变的PPRV 制备相应的PPRV 反向遗传致弱活疫苗。该疫苗的缺点为不能通过血清学检测免疫羊群是否感染PPRV 野毒。

4 核酸疫苗

1990 年，Wolff 等 报 道 将 纯 化 的DNA 或RNA 通过肌肉注射到小鼠体内，载体上的基因能在体内表达并可持续数月甚至终生，这一发现为新型疫苗的开发开拓了新思路，也标志着核酸疫苗的诞生。核酸疫苗是将编码某种抗原的基因制成疫苗，免疫动物后该外源基因可在宿主体内表达抗原，从而诱导机体产生特异性抗体。相对于传统疫苗，核酸疫苗可同时激活细胞免疫和体液免疫，更接近于自然免疫反应，且在抗原呈递过程中无抗原表位变化。目前，在流感病毒、艾滋病病毒、乙型肝炎病毒、狂犬病病毒、结核杆菌及肺炎支原体等病原的核酸疫苗研究领域均取得了一定的进展，其中部分疫苗也进入了临床试验阶段。

朱学亮等［22］构建了表达PPRV 的F、H、M 蛋白 的 重 组 真 核 表 达 质 粒pEGFP－F、pEGFP－H 和pEGFP－HM＋FM，用重组质粒免疫山羊，能够诱导机体产生特异性抗体，并且与传统弱毒疫苗免疫相比，免疫羊在免疫后第4周血清抗体达到峰值，之后逐渐下降，而弱毒疫苗免疫山羊的血清抗体在免疫后第3周达到最高峰值，之后开始下降，研究还发现3种重组真核表达质粒免疫羊的抗体效价高于弱毒疫苗免疫羊。阮洋等［23］构建了表达PPRV 的F、H蛋白的真核重组质粒pCAGGS－H、pCAGGS－F，用重组质粒免疫小鼠，能够诱导小鼠产生特异性抗体，研究还发现H 蛋白的重组表达质粒的免疫原性强于F蛋白的。杨香芳构建了表达PPRV F 蛋白的重组质粒pCAGGS－F，该重组质粒在有无佐剂CpG的情况下，均能诱导小鼠产生较高的抗体水平。Wang Y 等［24］将PPRV 的H 基因插入到pSCA1质粒上，通过塞姆利基森林病毒（SFV）复制子构建了PPR 自杀性DNA 疫苗，将该质粒转染BHK－21细胞后可表达有生物活性的PPRV H 蛋白，将该疫苗通过肌肉注射免疫Balb／c小鼠，能够在小鼠体内检测到抗H 蛋白的特异性抗体，并能诱导淋巴细胞增殖和产生细胞免疫。PPRV 核酸疫苗的优点表现为免疫机体后产生抗体迅速，机体产生抗体的效价高，可通过血清学检测确认免疫羊群是否感染PPRV野毒，同时还具有制备周期短，储存条件简单等。但因该疫苗为重组质粒核酸疫苗，使得其在机体会受到核酸酶的降解，降低其对动物机体的保护周期。

5 展望

2011年FAO 和OIE 联合发布全球根除RPV计划，成为动物疫病防控历史上的里程碑。考虑到从病原学特性及致病机理等方面同RPV 的相似性，很多学者提出PPR 可以作为下一个全球最有可能消灭的动物疫病。在广泛使用弱毒疫苗免疫的情况下如何实施根除计划，需要坚实的理论基础和有力的技术手段支持，因此，针对于PPRV 的致病机理的深入研究更加重要，并且以此为基础的新型疫苗的开发以及特异性诊断技术的研究尤为迫切。就笔者看来，在广泛使用弱毒疫苗免疫的情况下，可通过血清学检测区分疫苗毒和野毒株感染的基因工程疫苗将是PPR 疫苗发展的方向，上述4种基因工程疫苗中，除反向遗传致弱活疫苗外其余3种疫苗均可通过血清学方法检测羊群是否感染PPRV 野毒，因此这3种疫苗可在建立PPR 无疫病区时发挥积极作用。反向遗传致弱活疫苗是完全保留了PPRV免疫原性的活疫苗，并且在宿主体内复制不会出现毒力返强的现象，较传统疫苗相比其安全性极大增强，并可针对不同基因型的PPRV 快速制备针对性较强的疫苗，迅速控制疫情的发展，因此PPRV 反向遗传致弱活疫苗是未来PPR 预防及疫情控制研究的一个新热点。

［1］ 王志亮，包静月，吴晓东，等.我国首例小反刍兽疫诊断报告［J］.中国动物检疫，2007（8）：24－26.

［2］ Diallo A，Minet C，Berhe G，et al.Goat immune response to capripox vaccine expressing the hemagglutinin protein of peste des petits ruminants［J］.Ann N Y Acad Sci，2002，969：88－91.

［3］ Caufour P，Rufael T，Lamien C E，et al.Protective efficacy of a single immunization with capripoxvirus－vectored recombinant peste des petits ruminants vaccines in presence of pre－existing immunity［J］.Vaccine，2014，32（30）：3772－3779.

［4］ Qin J，Huang H，Ruan Y，et al.A novel recombinant peste des petits ruminants－canine adenovirus vaccine elicits long－lasting neutralizing antibody response against PPR in goats［J］.PLoS One，2012，7（5）：e37170.

［5］ Wang Y，Liu G，Chen Z，et al.Recombinant adenovirus expressing F and H fusion proteins of peste des petits ruminants virus induces both humoral and cell－mediated immune responses in goats［J］.Vet Immunol Immunopathol，2013，154（1－2）：1－7.

［6］ Rojas J M，Moreno H，Garcia A，et al.Two replication－defective adenoviral vaccine vectors for the induction of immune responses to PPRV［J］.Vaccine，2014，32（3）：393－400.

［7］ Rojas J M，Moreno H，Valcarcel F，et al.Vaccination with recombinant adenoviruses expressing the peste des petits ruminants virus F or H proteins overcomes viral immunosuppression and induces protective immunity against PPRV challenge in sheep［J］.PLoS One，2014，9（7）：e101226.

［8］ Rahman M M，Shaila M S，Gopinathan K P.Baculovirus display of fusion protein of peste des petits ruminants virus and hemagglutination protein of rinderpest virus and immunogenicity of the displayed proteins in mouse model［J］.Virology，2003，317（1）：36－49.

［9］ Michel M L，Tiollais P.Hepatitis B vaccines：protective efficacy and therapeutic potential.［J］.Pathol Biologie，2010，58（4）：288－95.

［10］ Castilho Leda R.Virus－like particles in vaccine development［J］.Expert Rev Vac，2010，9（10）：1149－1176.

［11］ 王秋霞.小反刍兽疫病毒样颗粒的装配与释放研究［D］.北京：中国农业科学院，2013.

［12］ 刘拂晓.小反刍兽疫病毒样颗粒的构建及对小鼠免疫效力的评价［D］.吉林长春：吉林大学，2013.

［13］ Liu F，Wu X，Zou Y，et al.Peste des petits ruminants viruslike particles induce both complete virus－specific antibodies and virus neutralizing antibodies in mice［J］.J Virol Meth，2015，213：45－49.

［14］ Liu F，Wu X，Zhao Y，et al.Budding of peste des petits ruminants virus－like particles from insect cell membrane based on intracellular co－expression of peste des petits ruminants virus M，H and N proteins by recombinant baculoviruses［J］.J Virol Meth，2014，207：78－85.

［15］ Liu F，Wu X，Li L，et al.Formation of peste des petits ruminants spikeless virus－like particles by co－expression of M and N proteins in insect cells［J］.Res Vet Sci，2014，96（1）：213－216.

［16］ Li W，Jin H，Sui X，et al.Self－assembly and release of peste des petits ruminants virus－like particles in an insect cell－baculovirus system and their immunogenicity in mice and goats［J］.PLoS One，2014，9（8）：e104791.

［17］ Wyatt L S，Moss B，Rozenblatt S.Replication－deficient vaccinia virus encoding bacteriophage T7 RNA polymerase for transient gene expression in mammalian cells.［J］.Virology，1995，210（1）：202－205.

［18］ 翟军军.小反刍兽疫病毒全长cDNA 的构建及DNA 疫苗的免疫学研究［D］.北京：中国农业科学院，2012.

［19］ Hu Q，Chen W，Huang K，et al.Rescue of recombinant peste des petits ruminants virus：creation of a GFP－expressing virus and application in rapid virus neutralization test［J］.Vet Res，2012，43：48.

［20］ Yin C，Chen W，Hu Q，et al.Induction of protective immune response against both PPRV and FMDV by a novel recombinant PPRV expressing FMDV VP1［J］.Vet Res，2014，45：62.

［21］ Muniraju M，Mahapatra M，Buczkowski H，et al.Rescue of a vaccine strain of peste des petits ruminants virus：In vivo evaluation and comparison with standard vaccine［J］.Vaccine，2015，33（3）：465－471.

［22］ 朱学亮.小反刍兽疫核酸疫苗的初步研究［D］.新疆乌鲁木齐：新疆农业大学，2009.

［23］ 阮 洋.小反刍兽疫病毒F、H 基因的核酸疫苗及N 蛋白的原核表达研究［D］.吉林长春：吉林农业大学，2011.

［24］ Wang Y，Liu G，Shi L，et al.Immune responses in mice vaccinated with a suicidal DNA vaccine expressing the hemagglutinin glycoprotein from the peste des petits ruminants virus［J］.J Virol Meth，2013，193（2）：525－530.