布鲁菌病细胞免疫诊断靶点抗原研究进展

杜 强，徐正中，陈 祥，焦新安

（扬州大学 江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州225009）

布鲁菌病（Brucellosis）（布病）是由布鲁菌引起的一类慢性传染病。布鲁菌可感染人和多种动物，且各生物种的毒力和致病力各不相同，沙林鼠布鲁菌、绵羊布鲁菌、犬布鲁菌、牛布鲁菌等分别主要感染啮齿动物、绵羊、犬、牛等；而人感染的布鲁菌菌型以羊型最多见，牛型最少。感染布病会累及多个器官的功能衰退，严重者丧失劳动和生活能力。由于布病自身特点和疫苗的使用，使布病的诊断中容易出现交叉反应和假阳性。现阶段，布病的实验室诊断手段主要有：①细菌学方法。通过培养病原体，根据其生物学特征进行判断。细菌学诊断方法是布病诊断的“金标准”，诊断的可靠性和准确性最高［1］。②分子生物学技术。Baily G G 等［2］建立了布鲁菌属细菌特异性的PCR 检测方法，Bricker B J等［3］针对布鲁菌的插入序列IS711建立了AMOS－PCR 方法；丁家波等［4］建立的布鲁菌属鉴定多重PCR 方法可对不同种的布鲁菌进行快速、敏感、准确地鉴别。③血清学方法。包括试管凝集试验（SAT）、虎红平板凝集试验（RBPT）、补体结合试验（CFT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）等。RBPT 快速方便，适于大量筛选；SAT、CFT 的敏感性和特异性相对较高，是一些国家和机构公认的确诊试验［5］。ELISA 是公认的特异性和敏感性相对较高的布病诊断方法。

布鲁菌是一种兼性胞内寄生菌，感染机体后主要引起细胞免疫为主，体液免疫为辅的免疫应答。而细胞介导的免疫反应可以产生较多的细胞因子，在机体对抗感染的过程中发挥重要的作用。对于不同细胞因子的检测，一方面反映机体的免疫水平和感染状况，另一方面在机体感染布鲁菌的初期就能特异性地检测到较高水平的细胞因子释放，这为布病的及时诊断提供了手段。现阶段细胞免疫学诊断方法的研究多为寻找合适的免疫原性蛋白［6］，这些蛋白可以激活T 细胞反应，包括活化巨噬细胞和CD4＋、CD8＋T 细胞，产生几种重要的细胞因子，如IFN－γ、TNF－α等。这些细胞因子在清除机体内布鲁菌的过程中起着重要的作用。特别是IFN－γ的分泌是宿主产生T 细胞免疫反应的重要指标，其在对抗布鲁菌感染中起着重要作用，检测IFN－γ分泌状况可间接反映微生物感染机体后不同蛋白在体内刺激产生细胞免疫的状况。鉴于针对细胞因子的检测在结核病诊断中的成功应用，抗原特异性的IFN－γ检测可以成为牛、羊等动物布病诊断的潜在手段之一［7］。Tittarelli M 等［8］使用RB51株分离纯化的蛋白对RB51 疫苗免疫过的奶牛进行全血体外刺激IFN－γ释放试验，通过与CFT 结果比较发现，该方法具有良好的敏感性和特异性。Ferrer D M 等［9］使用多种抗原蛋白作为刺激原对Rev.1疫苗免疫过的羊血样进行刺激试验，可检测到较高水平的IFN－γ释放。目前布鲁菌免疫原性蛋白的研究主要集中在外膜蛋白和菌体蛋白。

1 外膜蛋白

外膜蛋白（Omp）是原核生物细胞膜的重要组成成分，在维持细菌正常形态结构及细菌在机体内的生存和繁殖中发挥着重要作用。Omp 分子免疫学和基因组学的分析表明，其在疾病临床诊断和疾病预防方面具有潜力。Omp具有较强的免疫原性，能够刺激机体产生免疫应答反应，产生重要的细胞因子，因此成为重要的免疫诊断靶点。

1.1 BCSP31蛋白

BCSP31蛋白（布鲁菌细胞膜蛋白31）分子质量约为31ku，是重要的布鲁菌Omp之一，在多种布鲁菌间基因同源性达100%，该蛋白具有良好的免疫反应性和特异性。利用蛋白芯片进行布鲁菌蛋白免疫学检测时发现，BCSP31 的抗体只存在于感染的山羊血清中，而在感染布鲁菌的人血清中并未发现其抗体，预示该蛋白在检测区分人群的布病感染和疫苗免疫中具有应用前景。基于BCSP31基因建立的分子生物学检测方法在布病特异性诊断上的应用，BCSP31 蛋白有望成为布病血清学特异性诊断靶点［10］。

1.2 Omp10蛋白

Omp10蛋白（外膜蛋白10）属于菌体外膜脂蛋白，大小约为10ku，是布鲁菌重要的抗原蛋白，存在于所有的布鲁菌中。Omp10是一类不完整的Omp，具有脂蛋白特性，保持较强的抗原性。更重要的是该蛋白与自然感染牛的血清不发生反应，但可与自然感染羊的血清发生反应，因此可以作为布病区别诊断的候选诊断靶点之一。陈瑶等［11］将Bp26 和Omp 10蛋白联合应用于布病的血清学检测，提高了检测的敏感性，并且能够区分自然感染与疫苗接种。因此，以Omp10作为区别诊断抗原在临床检测中具有应用前景。

1.3 Omp31蛋白

Omp31蛋白（外膜蛋白31）是粗糙型布鲁菌最重要的保护性抗原蛋白之一，其基因存在于除牛种之外其他所有的布鲁菌中，基因序列同源性高达98%以上。Omp31蛋白是一种优势的T 细胞免疫抗原，具有作为细胞免疫诊断靶点的潜力。Gupta V K 等［12］发现重组Omp31蛋白可以刺激机体产生针对Omp31蛋白的抗体，并且刺激T 细胞增殖，诱导免疫细胞释放大量的IFN－γ。Wang W 等［13］使用Bp26和Omp31的多肽链刺激羊种布鲁菌疫苗免疫后的绵羊全血，结果发现两者的多肽链可以引起免疫细胞分泌大量的IFN－γ，表明多肽（蛋白）刺激全血后IFN－γ的分泌与病原菌感染之间存在相关性。更重要的是，由于Omp31基因在牛种布鲁菌中的缺失，使得Omp31抗原蛋白成为牛种布病区别诊断最重要的诊断靶点之一。

1.4 Bp26蛋白

Bp26蛋白（外膜蛋白26）是布鲁菌的结构蛋白和功能蛋白，其DNA 序列具有高度的同源性。Bp26是由细胞内向细胞外释放的可溶性蛋白，是一种免疫优势抗原和重要的诊断抗原［14］，具有高敏感性、特异性和易于检测的优点。其在布鲁菌侵染宿主时可引起宿主的细胞免疫反应，诱导T 淋巴细胞增殖并且促使细胞因子表达量的增加。利用同源重组的方法，构建Bp26疫苗突变株M5－90－26，可用来区分该疫苗株免疫与自然感染［15］，显示其在布病诊断中的应用前景。同时，Bp26蛋白在一些疫苗中的表达存在明显的弱化甚至缺失的现象，表现其作为免疫诊断靶点的优势。通过原核表达的方式获得可溶性Bp26 蛋白，并以此建立iELISA 方法，与进口试剂盒比较发现该iELISA 的检测符合率可以达到96.67%，显示出该方法在布病临床检测中的应用价值［16］。因此，接种缺失株疫苗（如Bp26的缺失株疫苗）免疫的个体，再使用以Bp26蛋白建立的iELISA方法将检测不出阳性，这可以在布病的自然感染和疫苗免疫的区别诊断中发挥重要作用。

2 菌体蛋白

除Omp外，布鲁菌中的其他蛋白，如伴侣蛋白GroES及GroEL，核糖体蛋白L7／L12，Cu－Zn超氧化物歧化酶等同样具有免疫原性，它们也具有作为细胞免疫学诊断靶点抗原的潜力。

2.1 L7／L12蛋白

L7／L12蛋白（核糖体蛋白L7／L12）是布鲁菌胞浆核蛋白，是核糖体的重要组成部分，其在不同的布鲁菌中基因同源性高达97.1%以上。其是一种T细胞优势抗原，能特异性地刺激感染动物的单核细胞，并上调IFN－γ的转录和表达，在机体对抗布鲁菌入侵的过程中发挥重要作用［17］。以L7／L12为基础制备的DNA 疫苗可以引起机体产生体液免疫和细胞免疫应答，如利用重组表达质粒pCAGG－L7／L12进行小鼠免疫试验后，小鼠体内产生体液免疫应答和细胞免疫应答，使用ELISPOT 技术可测定小鼠脾脏淋巴细胞分泌较高水平的IFN－γ。接种B.abortus S19疫苗免疫的牛，其全血在体外通过B.abortus L7／L12 蛋白的刺激，可以诱发CD4＋和CD8＋T 细胞增殖反应，并释放大量的IFN－γ［17］。表明病原菌感染牛以后，抗原蛋白体外刺激感染牛全血所产生的IFN－γ与疾病之间存在相关性，如果这种关系可以通过某种定量关系展现出来，这将成为布病细胞免疫诊断研究的重大突破。因此，L7／L12蛋白是免疫或感染的个体产生IFN－γ 的重要刺激原，具有成为细胞免疫诊断靶点的潜力。

2.2 GroEL蛋白

GroEL蛋白（伴侣蛋白GroEL）大小约为60 ku，广泛存在于病原微生物中，在蛋白质的正确折叠和组装、蛋白质的变复性以及跨膜转运等过程中起重要作用，同时也是一种免疫优势抗原。在布鲁菌感染机体以后，GroEL 能够参与诱导机体的体液免疫和细胞免疫［18］。GroEL 在进化过程中具有较高的保守性，作为诊断靶点具有一定的特异性。S19疫苗株免疫小鼠后，提取的小鼠脾脏细胞在GroEL体外刺激下可产生IFN－γ。这预示着疫苗免疫后，GroEL可刺激免疫细胞产生IFN－γ，表明GroEL 是一种良好的刺激原，是细胞免疫诊断靶点抗原的候选蛋白之一。

2.3 Cu－Zn SOD蛋白

Cu－Zn SOD 蛋白（超氧化物歧化酶）只存在于布鲁菌在内的少数细菌中，属于应激蛋白，是细菌为了适应巨噬细胞内恶劣环境而合成的一类蛋白。Cu－Zn SOD可以促使细胞代谢过程中产生的H2O2等发生歧化反应，保护布鲁菌不受这些物质的影响。Cu－Zn SOD也是一种具有T 细胞免疫活性的蛋白，能够刺激S19 疫苗株免疫小鼠的脾脏淋巴细胞活化，提高脾脏淋巴细胞IFN－γ表达水平［19］。与Gro－EL蛋白一样，Cu－Zn SOD 也是细胞免疫诊断靶点抗原的候选之一。从B.abortus RB51菌中提取的Cu－Zn SOD只与B.abortus感染牛的阳性血清发生特异性反应，而不与大肠埃希菌O157：H7以及耶尔森菌O：9 的 阳 性 血 清 发 生 反 应［20］。因 此，Cu－Zn SOD 蛋白在布病临床应用中可以有效降低与其他菌的交叉反应。

2.4 p39蛋白

p39蛋白（胞质结合蛋白p39）是布鲁菌胞质结合蛋白，具有良好的免疫原性。p39是良好的T 细胞抗原，可诱导产生Th1型细胞免疫应答，激发机体产生强烈的迟发型超敏反应，并显著提高IFN－γ的表达水平。报道显示p39在豚鼠体内可诱导强烈的T 细胞免疫反应，在检测出特异性抗体的同时，也能检测到IL－2、IFN－γ 和IL－12 等细胞因子的产生［21］。Letesson J J等［22］以p15－p39 作 为 抗 原，建立的iELISA 方法具有较高的敏感性，自然感染的绵羊和山羊血清的检出率分别为80%和96%，表明p39作为诊断抗原具有良好的敏感性和特异性。

3 其他蛋白

3.1 RepA－related蛋白

repA 相关基因是猪种布鲁菌与牛种、羊种布鲁菌的差异基因，是牛种强毒株544缺失基因，该基因参与编码布鲁菌功能蛋白。repA 相关基因在猪种、犬种等布鲁菌中存在，而在牛种、羊种布鲁菌中缺失，这种差异使RepA－related成为鉴别诊断的靶点之一。武宁等［23］用RepA－related蛋白作为包被蛋白建立了ELISA 检测方法，通过与RBPT、CFT 等方法对比发现，该ELISA 方法能够区分猪种布鲁菌S2疫苗免疫牛与牛种、羊种布鲁菌感染牛。

除此之外，通过微矩阵方法，利用不同年龄以及不同感染时期的病人血清，筛选出的高敏感性BMEII组蛋白可作为布病血清学诊断的候选抗原［24］。Ciocchini A E等［25］以耶尔森菌O：9的多糖和蛋白结合物作为抗原建立了糖蛋白结合物偶联磁珠法，其敏感性和特异性分别达到93%和100%。Brucellacapt方法是一种基于双抗体夹心ELISA 方法原理的一种免疫捕获凝集试验，和iELISA 方法对比发现Brucellacapt方法的敏感性和特异性分别为82.7%和88.9%［26］。

4 小结

布鲁菌是一种兼性胞内寄生菌，感染机体之后首先诱导细胞免疫应答，相关细胞因子进行分泌表达。随后诱导体液免疫应答，产生抗体以抵御病原菌。因此，抗体水平的检测不能及时地监测布鲁菌感染。IFN－γ的分泌是机体发生细胞免疫反应的重要指标，淋巴细胞经特异性抗原蛋白刺激后IFN－γ的分泌情况可反映机体的感染状态。因此，对细胞因子的检测意义在于能够及时反映宿主的感染状况。Omp和菌体蛋白等具有激发机体产生细胞免疫反应的潜力，是产生特异性细胞因子的潜在刺激原及细胞免疫诊断靶点的候选蛋白，利用这一特点可以为细胞免疫学诊断方法的建立提供理论依据。在牛结核病的诊断中，使用结核分支杆菌抗原蛋白及结核菌素（PPD）刺激外周血进行IFN－γ体外释放试验是主要的一种细胞免疫诊断方法。通过与标准方法的比对，设立合理的临界值，可以将IFN－γ值与结核病感染紧密的联系起来。因此，在布病的细胞免疫诊断研究中包括使用布鲁菌抗原蛋白以及布鲁菌素（Br－PPD）进行牛外周血IFN－γ 体外释放试验［9－10，17］也显示出良好的研究前景。在抗原蛋白及Br－PPD体外刺激下，接种布鲁菌疫苗免疫的牛外周血可以释放大量的IFN－γ，IFN－γ的释放水平与Br－PPD 皮试试验血清抗体凝集动态变化之间存在相关性［27］，并且调高抗原蛋白的刺激浓度可以上调IFNγ释放水平［28］。在提高淋巴细胞IFN－γ释放水平的基础上，如能摸索出IFN－γ释放量与布病感染间的关系，布病的细胞免疫诊断方法将有望进入临床应用。

近年对于布鲁菌蛋白功能的研究有限，随着蛋白组学技术的不断成熟，对这些蛋白的研究也会不断深入。一种或几种靶点蛋白，在体外通过单一或者结合的方式刺激特异性细胞因子的释放能够反映布病的感染状态，不仅如此，一些特异性的靶点蛋白还可用于区分自然感染和疫苗接种，这对于布病的诊断具有重大的意义。

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