荚膜多糖及其疫苗研究进展

张 哲，李新圃，杨 峰，罗金印，王旭荣，刘龙海，李宏胜＊

（1.甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州730070；2.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所农业部兽用药物创制重点实验室 甘肃省新兽药工程重点实验室，甘肃兰州730050）

荚膜是细菌的特殊结构，存在于一些细菌细胞壁外的一层黏液性物质，可保护细菌免受抑菌或杀菌物质的侵害以及宿主吞噬细胞的吞噬，同时还有助于细菌黏附于宿主细胞表面以诱发感染，是细菌得以生存的重要表面结构。有些细菌的荚膜成分主要为多糖，是细菌重要的保护性抗原和毒力因子，同时也是细菌结构变化最少的表面抗原，具有较好的免疫原性，是最适宜做疫苗的靶抗原之一［1－2］。荚膜多糖（capsular polysaccharide，CP）具有良好的免疫原性，被广泛应用于多糖疫苗的研制。荚膜多糖疫苗与传统疫苗相比，其成分单一，不存在易引起免疫副反应的物质，使得该类疫苗更为安全、有效，已成为应用最多的疫苗之一［3］。本文从荚膜多糖的生物学作用，作用机制，提取合成工艺及影响因素，荚膜多糖疫苗的研制及应用，荚膜多糖疫苗的发展前景以及存在的问题等方面进行了综述，以期为进一步了解和研究该类疫苗积累资料。

1 荚膜多糖的生物学作用

许多细菌，如肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、B 群链球菌、B型流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌和伤寒沙门菌等，其表面都有荚膜［4］。荚膜多糖既是基本的毒力因子也是细菌重要的保护性抗原，对于细菌的生长繁殖有着重要的作用。荚膜多糖的作用主要表现在：①黏附作用 荚膜多糖能够促进细菌与细胞表面或细菌之间的黏附，从而促进生物被膜的形成和细菌在不同环境中的定植。②耐干燥 荚膜层含水量在95%以上，围绕在细菌的表面，可以保护细菌免受脱水的损害。③抵抗宿主非特异性免疫 荚膜处于细菌最外层，可有效保护菌体免受或少受多种杀菌、抑菌物质的损伤；在生理pH 条件下，大部分细菌荚膜多糖带负电，可阻止带同种电荷的吞噬细胞的吞噬；且荚膜位于细菌的表面，能干扰宿主补体系统的激活［5］。④抵抗宿主特异性免疫 大部分细菌的荚膜多糖都可诱导宿主产生特异性免疫反应，但少数细菌的荚膜多糖免疫原性极低，如B群脑膜炎奈瑟菌的荚膜多糖与哺乳动物的胚胎组织及神经节苷脂中均含有乙酰神经氨酸组分；大肠埃希菌K5荚膜多糖具有与未硫酸化肝素类似的多糖重复骨架，而宿主的组织多糖也有与上述结构相似的组分。这类细菌的荚膜多糖免疫原性低，使得这些细菌能够抵抗宿主特异性免疫。

2 荚膜多糖的作用机制

荚膜多糖的发现最早可追溯至1917年Dochez和Avery发现的由肺炎球菌分泌于细胞壁外的一种可溶性物质，这种物质后来被证实为碳水化合物。1927年有学者研究发现，给小鼠注射肺炎球菌荚膜多糖可起到免疫保护作用，从而证实荚膜多糖具有免疫原性。但荚膜多糖是2型非T 细胞依赖性（TI－2）抗原，进入机体后无需Th细胞就能激发B 细胞产生相应的IgM 抗体，但不能产生IgG 抗体且无记忆性B细胞产生［6］。研究发现，肺炎荚膜多糖疫苗能降低老年人患肺炎的风险［7－8］，有效期为5 年，且对于女性患者的保护率大与男性患者，但小于2岁的儿童对该疫苗的抗体应答较弱甚至无应答。这可能是由于婴幼儿体内的B淋巴细胞表面尚未形成足够数量的IgM 受体分子，单纯荚膜多糖不能使B 细胞表面形成帽状结构从而诱导抗体产生。此外，对荚膜多糖抗原的免疫应答需要功能完整的脾脏。在婴儿出生后5 个月内，脾脏边缘区（marginalzone，MZ）仍未发育成熟，2岁以下幼儿MZ B细胞上的Ⅱ型补体受体的表达水平低下或缺失，因此单纯的荚膜多糖疫苗对婴幼儿的免疫原性低、不能诱导其产生免疫记忆应答，仅有短期的保护作用。

1929年Goebel及Avery 发现，将肺炎链球菌荚膜多糖共价偶联到蛋白载体上，免疫家兔能提高荚膜多糖的免疫原性，诱导T 细胞依赖性抗体的产生，这一理论首先被B 型流感嗜血杆菌（Hib）结合疫苗的成功研制所证实。将荚膜多糖与合适的蛋白质分子偶联，赋予荚膜多糖成分“载体效应”，就可克服不能产生以IgG 为主的抗体和无加强免疫应答效应的不足。试验证实这种共价结合抗原能诱发T细胞依赖性免疫应答反应，激活T 细胞分泌细胞因子，可增加婴幼儿体内血清抗体效价，诱导机体产生持久的免疫记忆反应。当多糖与载体蛋白质共价偶联免疫动物后，多糖－蛋白质结合物通过胞饮作用进入B细胞，在细胞内被水解成抗原肽，然后与胞质内MHCⅡ类抗原结合，形成抗原肽－MHCⅡ复合物并被分泌到B 细胞表面，从而可与Th细胞表面识别受体结合，促使该Th细胞活化、增殖并分泌一系列的细胞因子，这些细胞因子又可促使B 细胞增殖分化，产生IgG 和IgM 抗体，在增殖分化过程中有少量B细胞停止分化成为记忆性B 细胞［9］。据此，人们将荚膜多糖与合适的蛋白质分子进行偶联制成了荚膜多糖结合疫苗，克服了荚膜多糖疫苗存在的部分缺陷。

3 荚膜多糖的提纯工艺及合成影响因素

3.1 荚膜多糖的提取及纯化过程

荚膜多糖作为疫苗抗原，需有较强的免疫原性与足够的安全性。影响其免疫原性的因素很多，主要包括多糖分子质量大小、结构的完整性及特殊化学基团的含量。多糖中残存的核酸、蛋白质、致热源物质和纯化相关的试剂，是影响疫苗安全性的重要因素。为提高荚膜多糖疫苗的免疫原性，一般要对提取的荚膜多糖进行纯化，以达到最佳免疫效果。

3.1.1 去除菌体和收集总糖 传统工艺中，去除菌体主要用离心沉淀法，但其效果依赖于高效率的设备投入，现已逐渐被十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）法所取代。CTAB 是一种阳离子去污剂，能与多糖形成季胺络合物而沉淀多糖，并可共沉淀大部分的核酸和蛋白质［10］。CTAB 的沉淀作用与其浓度、pH、温度等因素有关。有报道指出，CTAB浓度越高，荚膜多糖沉淀效果越好；温度越高，效果越 差［11］。陈作 江 等［12］试 验 表 明，过 高 的CTAB 浓度不能增加其产量，且会增加复合多糖解离的难度。此外，超滤技术，如中空纤维法已逐步被用于荚膜多糖的提取与纯化。根据不同荚膜多糖分子的大小，选择适宜孔径大小的超滤膜，在起到浓缩作用的同时，还可去除比荚膜多糖小的大部分杂质［13］。

3.1.2 去除核酸与蛋白质 传统的荚膜多糖提取纯化工艺中，去除核酸与蛋白质多采用有机溶剂沉淀法。去除核酸常使用乙醇，离心除去核酸沉淀；去除蛋白质则主要靠苯酚抽提。鉴于有机试剂的毒性，人们尝试了无机物沉淀法。Kothari S等［14］在纯化伤寒Vi多糖时，采用无机物（硫酸铵）来沉淀多糖，结果表明硫酸铵能有效去除核酸。核酸和蛋白质都能被各自特异性的酶水解，但酶活性的发挥需要适宜的外界条件，且加入的酶无疑是一种外源性物质，因此对酶的来源有严格的要求。Takagi M等［11］在提纯Hib荚膜多糖时，以核酸内切酶降解核酸，链霉蛋白酶E和胰蛋白酶降解蛋白质，最终获得了符合相关规定的Hib荚膜多糖。

3.1.3 去除内毒素 内毒素即脂多糖（LPS），可引起人畜的发热、微循环障碍及休克等。去除内毒素可用超速离心法，但超速离心机十分昂贵、操作不便，且工艺放大较难。目前，传统的超速离心法正在被一种优化的超滤法所代替。由于脂多糖在水相中形成高分子聚合物，且其相对分子质量接近荚膜多糖，因此一般的超滤法很难除去内毒素。乙二胺四乙酸（EDTA）可以螯合LPS表面的带电离子，使带负电的LPS 相互排斥而解离成单体；脱氧胆酸钠（DOC）可以破坏LPS的疏水作用使其解聚，解聚的单体便可经超滤去除。总之，随着对疫苗质量标准和环保要求的不断提高，一些旧的生产工艺正逐渐被淘汰，乙醇、苯酚等试剂将逐渐被限制使用。对超滤、酶解及无机物沉淀等方法的探索研究，将有望开发出一套安全有效的荚膜多糖提取纯化工艺。

3.2 影响荚膜多糖合成的因素

细菌荚膜多糖的生物合成是一个与酶作用相关的复杂过程。该过程起始于对单糖的吸收或合成以及单糖对核苷酸诱导剂的激活，接着由膜结合转移酶复合物将已成功耦联的单糖催化形成一种膜结合脂质载体，最后由聚合酶类催化寡糖亚基的聚合，聚合完成后由运输因子将其输出胞外，并将完整的荚膜多糖锚定于细胞表面。荚膜多糖合成过程受到许多因素的影响，主要包括以下几个方面：

3.2.1 培养基成分 胞外荚膜多糖产生的量和多糖组成，往往与培养基中可利用碳源的种类有关。杨正涛等研究表明，与哥伦比亚培养基比较，BHI培养基降低了荚膜多糖产量，而mod 110培养基可提高其产量；同种培养基，以乳糖作为碳源可提高荚膜多糖产量。

3.2.2 二氧化碳含量 Herbert S等［15］1997年首次报道CO2作为一种环境信号可以调节金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖（CP5）的表达。当培养环境中增加5%的CO2时，CP5表达量显著减低，CO2在基因转录水平上，影响了荚膜多糖基因的表达。而后续的研究表明，CP8的表达并非总随CO2含量的增加而降低，这可能与cap基因启动子序列的不同有关。

3.2.3 氧气含量 发酵培养结果表明，溶解氧能促进荚膜多糖的产生，并且能使菌体在对数生长期之后仍然能持续形成荚膜多糖。假单胞菌、产碱杆菌属以及黄单胞菌在提供高溶氧的条件下能大量产生胞外多糖［16］。Linton 研究证明，在生物合成过程中，菌体对能量的需求伴随着对溶氧的需求，进而合成胞外多糖。

3.2.4 pH 的影响 培养基的pH 值也能够影响微生物胞外多糖的产生量。江元翔等在对脑膜炎球菌培养条件进行优化时发现，在pH 为6.6左右时，其荚膜多糖产量最高。在pH6.0～pH7.0 之间，Reynolds菌株在对数生长期之后仍然能够持续产生荚膜多糖；但是在pH8.0时，对数生长期之后基本再无荚膜多糖的产生，且最终荚膜多糖的总量较少。

4 荚膜多糖疫苗的研制及应用

由于荚膜多糖具有良好的免疫原性，目前以荚膜多糖为靶抗原已成功制备了多种细菌疫苗，这些疫苗在疾病的预防和控制方面发挥了巨大的作用，大大降低了相关疾病的发病率。由于单纯的荚膜多糖疫苗存在很多缺陷，目前的研究主要集中在荚膜多糖结合疫苗。

4.1 人用荚膜多糖疫苗的研究

4.1.1 肺炎球菌荚膜多糖疫苗 肺炎球菌根据其荚膜多糖成分的不同，按照“丹麦命名系统”，可将其分成48个血清群91个血清型。在全球范围内，有20种血清型与超过85%的肺炎有关，其中13种最常见的血清型与70%～75%的儿童侵袭性肺炎有关。1978年，含14个血清型的肺炎链球菌14价荚膜多糖疫苗（PPV14）在美国正式上市；1983 年，世界卫生组织建议用新研制的23 价荚膜多糖疫苗（PPV23）代替PPV14；成都生物制品研究所于2000年研制出PPV23，并于2006 年上市。有关PPV23的研究表明，PPV23对相应疾病的保护率为50%～70%，但小于2岁的儿童对该疫苗的抗体应答较弱甚至无应答［8］。肺炎球菌7 价结合苗（PCV7）于2000年获准上市，但研究表明，该疫苗的应用使得非疫苗型肺炎球菌所致疾病的发病率升高了25%。为降低血清型替代造成的影响，2009年－2010年，10价和13 价结合疫苗又分别被批准上市［17］。其中，辉瑞开发的Prevenar13是目前使用最广的肺炎球菌疫苗，已获全球120多个国家批准［18］。国内目前有四家企业正在研制PCV13，且均已进入临床试验申报程序。

4.1.2 脑膜炎球菌荚膜多糖疫苗 脑膜炎奈瑟菌（Nm）俗称脑膜炎球菌，是流行性脑脊髓膜炎的病原菌。根据其荚膜多糖的不同，脑膜炎球菌可分为13个血清群，其中A、B、C、Y 和W－135群是主要的致病血清群［19］。1981年，第一个A、C、W－135及Y 型脑膜炎球菌四价多糖疫苗在美国获得上市。我国从1972年开始试制Nm 多糖疫苗，目前国内上市的脑膜炎球菌荚膜多糖疫苗（MenV）主要有4种，包括A群MenV、A＋C群MenV、A、C、Y、W－135群MenV和A＋C群MenV 结合疫苗。这四种疫苗经试验证实具有良好的免疫原性、安全性及稳定性［20］。A、C、Y、W－135群流脑结合疫苗已在国外上市，由我国沃森生物技术有限公司研制的荚膜多糖结合疫苗已于2015年2月进入临床研究阶段。

4.1.3 伤寒荚膜多糖疫苗 伤寒是由伤寒沙门菌引起的一种急性传染病，全球每年发生的伤寒病例在2 160万～2 690万之间，2000年约有21万病人死亡［21］。自19世纪末首次应用伤寒菌体菌苗预防伤寒以来，各国先后研制出10余种伤寒菌苗，但多数由于免疫效果差或副作用大而被淘汰。目前，国际上以伤寒Vi多糖疫苗的应用占绝大多数，该疫苗是从伤寒沙门菌的荚膜多糖中提取纯化的Vi多糖制成。与灭活疫苗相比，Vi多糖疫苗具有安全性好、副反应低、使用方便等优点。但该疫苗对2岁以下儿童无效，为此，国内外不少机构开始研制结合疫苗，美国国立卫生研究所（NIH）将伤寒杆菌Vi多糖与重组绿脓杆菌外毒素A（rEPA）偶联制备出了Vi多糖结合疫苗［22］。我国兰州生物制品研究所率先开展了Vi－rEPA 结合疫苗的研制。玉溪沃森生物技术有限公司研制的伤寒Vi多糖结合疫苗，目前正处于临床试验申请阶段。

4.1.4 Hib 荚 膜 多 糖 疫 苗 B 型 流 感 嗜 血 杆 菌（Hib）是儿童鼻咽腔常见的寄生菌，可引起儿童肺炎和脑膜炎，全球每年约38.6万患者死亡［23］。Hib荚膜多糖主要成分是多聚核糖基核糖醇磷酸盐（PRP），具有较好的免疫原性。1985年美国和芬兰首次以PRP制备的Hib荚膜多糖疫苗，并用于儿童免疫。随着Hib结合疫苗成功研制，PRP疫苗已被Hib结合疫苗所取代。目前市场上主要有4种Hib结合疫苗［24］，分别为以白喉类毒素、减毒白喉类毒素、脑膜炎双球菌外膜蛋白和破伤风类毒素为载体的荚膜多糖结合疫苗。

4.2 兽用荚膜多糖疫苗研究

与人用荚膜多糖疫苗的研究相比，兽用荚膜多糖疫苗的研发起步较晚。目前，兽用荚膜多糖疫苗的研究主要集中在奶牛乳房炎疫苗开发方面。奶牛乳房炎是奶牛业最严重的疾病之一，已严重影响畜牧业的发展和人类健康。由于疫苗接种预防乳房炎具有安全无毒的特点，被认为是一种较为安全、有效的方法［25］。引起奶牛乳房炎的病原菌多达150 多种，但95%以上的乳房炎是由链球菌、葡萄球菌和大肠埃希菌引起。因此，用这几种病原菌制备疫苗用来预防乳房炎是国内外学者研究的重点［26－27］。

金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎最主要的一种病原菌。据报道，从美国和欧洲的奶牛乳房炎病乳中分离的金黄色葡萄球菌，分别有100%和98%血清型为5型、8型和336型。Fattom A 等［28］将5型、8型的荚膜多糖偶联到绿脓杆菌外毒素A 或白喉毒素上，可有效预防金黄色葡萄球菌性乳房炎。Edridge等将纯化的金黄色葡萄球菌血清型5型、8型和336型的荚膜多糖结合到载体蛋白和可生物降解的微球中，可提高其调理性抗体效价。林树乾等2006年将提取的荚膜多糖与牛血清白蛋白偶联，制成了多糖结合疫苗。关于链球菌疫苗的研究较少，主要是关于无乳链球菌和乳房链球菌，但效果都不理想。Poutrelr等用一种绝大多数链球菌都有的蛋白X 与B族链球菌荚膜多糖偶联组成的疫苗，能诱导调理性抗体产生。然而，到目前为止尚无有效预防链球菌性乳房炎的商品化疫苗面市。关于大肠埃希菌荚膜多糖疫苗的研究尚未见报道。

在经历了三次疫苗革命后，对于奶牛乳房炎的防治取得很大进展，但还未能得到根本的解决。提高抗原的免疫原性以及乳腺的反应强度，利用分子生物学技术进一步改进疫苗的设计程序，选择交叉血清性强的菌株以抵抗更多的血清型病原的感染，将是今后奶牛乳房炎疫苗研制的重点。

5 前景及展望

荚膜多糖作为细菌的重要表面抗原，其结构特征、合成机制与生物功能，已越来越受到人们重视。荚膜多糖疫苗作为一种新型疫苗，经过几十年的发展，已从最初单纯的多糖疫苗发展到现在的多糖结合疫苗，对传染病的防控具有重大意义。荚膜多糖疫苗价格便宜，免疫仅需一针，更适用于经济落后地区相关疾病的防控。多糖结合疫苗研发困难，价格较高，但它能激发≤2岁儿童、老年人和免疫缺陷者产生有效的免疫应答，且能维持较长时间。因此，两种疫苗的并存有利于优势互补，对我国相关疾病的预防和控制具有重要意义。由于致病菌血清型的增多，使得人们不得不研发包含更多血清型的多价结合疫苗。这一方面增加了疫苗研发的难度，使得结合疫苗的制备成本增高，限制了其在发展中国家的应用；另一方面，随着结合疫苗价数和载体蛋白剂量的增加，结合物之间或共免疫抗原之间产生干扰的可能性就越大。因此，廉价有效的结合疫苗应是今后研发的重点。随着对结合疫苗免疫机制的进一步了解以及新型载体蛋白的不断发现，研发更有效廉价的荚膜多糖结合疫苗是十分有希望的。

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