观察比较贝母类生物碱分布的3种切片方法

张鹏葛，盛 萍，任慧梅，安露莎，卢晓丽，王延蛟

(新疆医科大学 中医学院，新疆 乌鲁木齐 830011)

观察比较贝母类生物碱分布的3种切片方法

张鹏葛，盛 萍*，任慧梅，安露莎，卢晓丽，王延蛟

(新疆医科大学 中医学院，新疆 乌鲁木齐 830011)

目的：建立一种能更清楚有效地观察贝母鳞茎中生物碱沉淀分布及含量的切片方法。方法：以新疆贝母为供试材料，利用石蜡切片法、徒手切片法及改良切片法制备植物鳞茎组织切片；切片经改良碘化铋钾处理，并通过Mikroskop Primo Star X2005显微镜观察和比较3种不同切片中生物碱沉淀分布。结果：改良切片法处理的切片中生物碱沉淀分布观察清晰，可用于定性及定量分析，并且实验过程中试剂对生物碱的影响较小，操作方法简便、快速、有效。结论：贝母鳞茎生物碱的观测适合采用改良切片法制片。

贝母；石蜡切片法；徒手切片法；改良切片法

石蜡切片法是以石蜡作为包埋剂，经一系列处理制作永久装片的方法，是观察植物细胞最常用、最基本的一种方法[1]。其制作的一般流程为：取材、固定、脱水、透明、浸蜡和包埋、切片、粘片、染色、封片等九个环节[2]，并且各个环节互相制约，每一步骤对制片的质量都有着极大的影响。徒手切片法是直接使用刀片将植物新鲜材料切成薄片的一种制片方法，操作方法简便，快速[3]。近年，利用切片技术结合组织化学方法研究植物有效成分的分布及组织结构多见报道[4-6]，但不同植物及植物不同部位具有不同有效成分及组织结构，因而需要根据植物的组织结构特点及研究目的选择或创新相应的制片方法。

贝母是一种常用中药, 在我国有悠久的用药历史，来源于百合科(Liliaceae)贝母属(FritillariaL.)多种植物的鳞茎，具有清热润肺，化痰止咳之功效[7]。现代药理研究表明，贝母中的生物碱，是其止咳、化痰作用的主要有效成分[8]。近年，应用切片技术对贝母中生物碱进行组织化学定位研究已见报道[9]，但由于贝母鳞茎组织结构中富含大量淀粉粒，对其生物碱沉淀观测中有很大影响，因此为了更清楚有效地观察贝母药材鳞茎中生物碱沉淀的分布和含量，本文结合贝母药材鳞茎组织结构特点采用一种改良切片法，并与传统石蜡切片技术及徒手切片法进行比较，旨在探索出一种适于贝母鳞茎中生物碱沉淀观测的切片方法。

1 仪器与材料

Mikroskop Primo Star X2005型数码显微镜，YD-202A轮转式切片机。供试材料经新疆医科大学中医学院盛萍教授鉴定为百合科(Liliaceae)植物新疆贝母(FritillariawalujewiiRegel)的干燥鳞茎。

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1 石蜡切片法

取材 — FA固定液(70%乙醇 ∶福尔马林=18 ∶1, 真空抽气30 min)固定24 h[9]— 脱水(依次70%、80%、90%、95%、100%、100%乙醇每级0.5～1.5 h)— 透明(1/2二甲苯+1/2乙醇2 h、纯二甲苯30 min)— 透蜡(1/2二甲苯+1/2石蜡45 ℃过夜、打开瓶口60 ℃ 2 h、纯石蜡2 h、纯石蜡2 h)— 包埋 — 切片、贴片 — 展片 — 染色观察。

2.1.2 徒手切片法

取材—软化(蒸馏水中浸泡5 min)—徒手切片—湿毛笔将薄片放入含有蒸馏水培养皿中—挑选透明的薄片—染色观察。

2.1.3 改良切片法

取材—软化(1/2 50%乙醇+1/2甘油3～6 h，真空抽气30 min)—冷冻4～8 h或过夜[10]— 切片机切片[11- 12](用胡萝卜将供试材料夹在其中，一起放入切片机夹头固定，切片)— 湿毛笔将薄片放入含有蒸馏水培养皿中漂洗2 min—将薄片放入FA固定液固定5 h—复水(50%乙醇、30%乙醇、蒸馏水每级1 min)—染色观察。对照组处理，将新鲜材料用酒石酸酒精预处理24 h后，用同样方法处理和观察。

2.2 结果

2.2.1 3种切片的生物碱沉淀观察

对新疆贝母鳞茎的3种切片进行生物碱沉淀反应后，均可观察到在新疆贝母鳞茎的薄壁组织细胞的细胞壁上含有较多黄色—深黄色生物碱沉淀，表皮细胞上有较少分布(低倍镜下呈小黑点)；对照组各组织细胞中无生物碱沉淀(图1:1-2)。石蜡切片的组织结构很完整，切片厚薄均匀，但含有大量淀粉粒覆盖在薄壁组织细胞中，滴加生物碱显色剂后，对生物碱沉淀的观测有一定影响(图1:3-4)；徒手切片的组织结构有部分破碎，切片厚薄不均，大量淀粉粒流失，并且生物碱沉淀随染液也流失严重(图1:5-6)；改良切片的组织结构较完整，切片厚薄差异小，大量淀粉粒流失，视界清晰，但生物碱由于固定液作用，随染液流失较少(图1:7-8)。

2.2.2 3种切片方法比较

3种切片方法的比较如表1所示，从表中可以看出，3种方法各有优缺点。石蜡切片对各组织结构观察很清楚且完整，但淀粉粒在薄壁组织细胞中分布较广，对生物碱沉淀的观测具有一定影响，适宜用于观察贝母的组织结构及其他化学成分的定位及定量分析。徒手切片操作简单，化学试剂使用少，仅配合滴染就可以直观的看到细胞的染色过程，不易造成生物碱化学成分的损失，但此种方法使贝母类生物碱沉淀随染液流失比较严重，且切片厚度不能控制，对生物碱分布只能定性，不能定量。改良徒手切片的各组织结构较完整，操作过程较简单，尤其针对贝母类生物碱沉淀的观察和测量，其试验效果良好；并且切片厚度可以控制，对总生物碱即可以定位也可以定量分析。

图1 新疆贝母鳞茎横切面生物碱组织化学定位(40×)

E. 表皮；Pa. 薄壁组织；SG. 淀粉粒；P. 生物碱沉淀. 1-2.新疆贝母鳞茎对照组横切面，示各组织细胞中无生物碱沉淀；3-4.新疆贝母鳞茎石蜡切片，示各组织细胞中生物碱沉淀分布；5-6.新疆贝母鳞茎徒手切片，示各组织细胞中生物碱沉淀分布；7-8.新疆贝母鳞茎改良切片，示各组织细胞中生物碱沉淀分布。

表1 3种切片方法比较

3 讨 论

在细胞生物学和植物学研究中，切片制作的质量非常重要，往往对实验的进展及结果有直接影响。不同动植物及动植物不同部位具有不同组织及细胞结构特征，因而需要根据动植物的组织及细胞结构特点结合实验目的选择或创新相应的制片方法，使实验结果更加完美。通过本实验中3种切片技术结合组织化学方法对贝母类生物碱沉淀的观测，结果显示：3种切片方法均能观察到植物的组织结构和生物碱沉淀，但其清晰度，完整性及定量定性分析各有不同。徒手切片操作简单，新鲜材料组织结构和细胞的天然色彩可以直接观察，且操作过程使用化学试剂较少，对操作者伤害较小，但由于切片厚度无法控制，因此在组织化学中无法对有效成分进行定量分析[13]。石蜡切片可以得到完整的组织结构，且切片厚度可以控制，可对供试材料进行定性及定量分析[14-15], 但操作过程繁琐及使用化学试剂较多，对操作者和材料影响较大。近年，一些替代徒手切片的简易机械制作研究已见报道[11-12]，根据其机械制作原理结合石蜡切片和徒手切片技术优缺点进行分析，并针对贝母类生物碱沉淀观测，改良出一种结合切片机的改良切片方法。

贝母鳞茎质地较硬，生物碱为其有效成分，因此选择材料需要体积较小或切成1.0 cm×0.5 cm方块大小，不能使用含有酸的软化剂[9]，蒸煮软化法温度过高对组织结构及化学成分有影响，为此软化剂选用1/2 50%乙醇+1/2甘油，抽气可以加速软化剂浸入。根据文献[10]，冰冻后切片更容易切制，并且软化剂经冷冻后在组织内可以起到一定支撑作用。切制过程中，为得到完整切片因选择锋利的刀片及较大的切片厚度，并保持切面湿润，切制的薄片在水中漂洗可以去除部分淀粉粒，降低淀粉粒对生物碱沉淀观察的影响。薄片在固定液中固定数小时，可以减少组织化学显色后生物碱沉淀随染液流失，固定时间过短起不到效果，过长会造成薄片损坏。

按照以上步骤制片，结果显示：组织结构较完整且清晰，淀粉粒对生物碱沉淀的观察影响较小，生物碱沉淀分布观察清晰，可用于定量分析，并且实验过程中试剂对生物碱的影响较小，操作方法简便、快速、有效。该方法为今后能更清楚有效地观察贝母类鳞茎中生物碱沉淀的切片技术提供一定的借鉴和参考。

因此，要制备一张高品质的切片，首先要分析不同植物及植物不同部位具有的组织结构特点，再结合研究目的，然后选择或创新相应的制片方法，不能按部就班。制备高水平的动植物切片需要长期摸索及创新，掌握好这项技术对今后动植物组织的研究具有重大的意义。

[1] 李贵全. 细胞学研究基础[M]. 北京: 中国林业出版社, 2001.

[2] 李和平. 植物显微技术[M]. 北京: 科学出版社, 2009.

[3] 李岩, 王幼群. 徒手切片与植物细胞微管免疫荧光定位[J]. 农业生物技术学报, 1997, 7(4): 382-385.

[4] 刘世彪, 林如, 胡正海. 绞股蓝人参皂苷的组织化学定位及其含量的变化[J]. 实验生物学报, 2005, 38(1): 55-58.

[5] 李景原, 王太霞, 沈宗根, 等. 六种芦荟叶的解剖结构及其与芦荟素含量的相关性[J]. 植物学报, 2003, 45(5): 597-600.

[6] 李金亭, 彭励, 胡正海, 等. 牛膝根的结构发育与三萜皂苷积累的关系[J]. 分子细胞生物学报, 2007, 40(2): 124-128.

[7] 国家药典委员会. 中国药典：一部[M]. 北京：化学工业出版社, 2010: 132.

[8] 李萍, 季晖, 徐国钧, 等. 贝母类中药的镇咳祛痰作用研究[J]. 中国药科大学学报, 1993, 24(6): 360-362.

[9] 杨杨, 姜虹, 傅华龙, 等. 野生和组培川贝母总生物碱含量的测定和定位研究[J]. 四川大学学报, 2008, 45(1): 209-213.

[10] 韩留福. 冰冻徒手切片[J]. 生物学通报, 2002, 37(6): 59.

[11] 岳丽红. 简易生物切片器[J]. 生物学教学, 2009, 34(6): 37.

[12] 李雪芬, 钟俊杰. 替代徒手切片的简易机械制作[J]. 生物学教学, 2007, 32(5): 34.

[13] 朱登峰, 唐冬英, 李明芳, 等. 观察木质部的3种切片方法比较[J]. 湖南农业科学, 2010, (7): 20-22.

[14] 王春燕, 黄秀燕. 适合植物组织原位杂交和原位PCR的切片制作[J]. 安徽农学通报, 2007, 13(7): 37-38.

[15] 吕洪飞, 罗文姬, 盛仙永, 等. 两种石斛属植物和小叶石仙桃生物碱的组织化学定位[J]. 中国药学杂志, 2006, 41(11): 824-827.

Comparison among Three Sectioning Methods to Observe theDistribution of Alkaloid in Bulbus Fritillariae

Zhang Pengge, Sheng Ping*, Ren Huimei, An Lusha, Lu Xiaoli, Wang Yianjiao

(School of Traditional Chinese Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)

Objective: In order to explore and establish a kind of plant sectioning method which could observe the distribution and content of alkaloid in Bulbus Fritillariae more clearly and effectively. Methods:FritillariawalujewiiRegel was taken as material, and tissue biopsies of plant bulb were prepared by paraffin section method, free-hand section method and improved section method. Then, these sections were staining by bismuth potassium iodide. The distribution of alkaloid in these sections were observed and compared through Mikroskop Primo Star X2005 microscope. Result: The improved section method could clearly observe the distribution of alkaloid in the plant cell structure and quantitative analysis, reagents had a little influence on alkaloid in experimentation, and the operation is simple, fast and effective. Conclusion: The improved section method are more appropriate for observing the distribution of alkaloid in Bulbus Fritillariae.

Bulbus Fritillariae; paraffin section method; free-hand section method; improved section method

2014-11-28

国家自然科学基金资助项目(81160544)。

张鹏葛(1991—)，男，在读硕士研究生。研究方向：从事特色中药资源质量标准研究工作。

*通讯作者：盛萍(1967—)，女，博士，教授，硕士生导师。研究方向：主要从事特色中药资源质量标准研究工作。E-mail: xjsphwy@163.com

10.3969/j.issn.1006-9690.2015.03.007

R932

A

1006-9690(2015)03-0027-04