东方肉座菌GH10家族木聚糖酶基因的克隆及异源表达

吴金连， 薛 勇， 黎海龙， 刘 健， 甘礼惠， 龙敏南

(厦门大学 能源学院， 厦门 361102)

东方肉座菌GH10家族木聚糖酶基因的克隆及异源表达

吴金连， 薛 勇， 黎海龙， 刘 健， 甘礼惠， 龙敏南

(厦门大学 能源学院， 厦门 361102)

木聚糖酶是降解半纤维素最主要的酶，对于开发可再生生物能源具有重要的应用价值。分别以东方肉座菌(Hypocreaorientalis)EU7-22的基因组DNA和cDNA为模板，利用染色体步移和PCR技术首次克隆获得该菌GH10家族木聚糖酶Ⅲ的基因(xynⅢ)，并对其进行生物信息学分析。结果表明：该基因全长1283 bp(gxynⅢ)，含有3个内含子；CDS序列为 1044 bp(cxynⅢ)，编码347个氨基酸，N端含有一个16 aa的信号肽序列； XYNⅢ氨基酸序列与Trichodermapseudokoningii的endoxylanase具有较高的同源性。经生物信息学分析，XYNⅢ成熟蛋白可能含有18个N-糖基化位点，其理论等电点(pI)为6.14，蛋白质分子质量为 36.55 ku，属于亲水性蛋白；SWISS-Model 建模预测，XYNⅢ成熟蛋白中含有11个α螺旋，其核心结构为8个β折叠片围成一个柱状结构。 同时将编码成熟蛋白的基因片段mxynⅢ与pPIC9K质粒连接构建表达载体后转化毕赤酵母，对重组子表达产物进行酶活检测显示该基因能在毕赤酵母中表达有生物活性的XYNⅢ并分泌到胞外，发酵液中的木聚糖酶活在诱导培养168 h后可达到 127.5 IU/mL。

东方肉座菌；木聚糖酶Ⅲ；基因克隆；生物信息学分析;异源表达

半纤维素的结构主要由 β-D-吡喃木糖残基经 β-1,4-糖苷键连接而成的主链以及各种侧链(如葡萄糖醛酸侧链、阿拉伯糖侧链等)组成，因此半纤维素的彻底降解需要木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、葡萄糖醛酸酶等的协同作用[1]，其中木聚糖酶是降解半纤维素过程中最重要的水解酶。木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是一类能够作用于木聚糖主链的糖苷键并生成木糖或低聚木糖的水解酶，在食品、造纸、纺织、医药及能源等领域具有重要的潜在应用价值[2]。木聚糖酶属于糖苷水解酶(Glycosyl Hydrolases, GH)，在GH5、7、8、10、11、26和43家族中均存在[3]。其中GH10和GH11家族是木聚糖酶中被研究得最多的两个家族，目前已从Malbrancheapulchella、ThermoanaerobacteriumsaccharolyticumNTOU1、MyceliophthoraThermophila、Thermoascusaurantiacus等微生物中克隆得到了GH10木聚糖酶[4-7]。但是到目前为止，在木霉属中仅有2个GH10木聚糖酶基因(Acession：EU360940.1和AB036796.1)被克隆。

木聚糖酶在自然界中分布广泛，可从动物、植物和微生物中直接分离纯化或者定向诱导表达获得，目前木聚糖酶的生产多数依靠真菌、细菌等微生物的发酵[8]。但是木聚糖酶在天然生物中表达水平低，且酶系组分复杂，分离纯化过程较为复杂且成本高限制了其大规模生产应用。利用基因工程技术从天然菌株中克隆木聚糖酶基因并实现其在合适的宿主中高效表达，可以克服以上缺点，同时还能获得特异性的木聚糖酶。而毕赤酵母就是一种较为理想的真核蛋白表达宿主。

东方肉座菌(Hypocreaorientalis)EU7-22是本课题组通过筛选、诱变获得的一株木霉属(Trichoderma)真菌。已有研究表明，该菌株不仅具有较高的滤纸酶、β-葡萄糖苷酶等纤维素酶活性[9]，而且具有较高的GH10和GH11家族木聚糖酶活力。通过对该菌株粗酶液进行SDS-PAGE及LC-MS/MS分析，推测GH10木聚糖酶是该菌株表达的主要木聚糖酶[10]。目前，本课题组已经成功地从该菌株中克隆了外切葡聚糖酶基因、内切葡聚糖酶基因及β-葡萄糖苷酶基因等纤维素酶基因，并实现了葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中的高效表达[9-10]。同样地，东方肉座菌EU7-22中的两个GH11木聚糖酶基因也被成功克隆并在毕赤酵母中重组表达[12-13]，但GH10木聚糖酶的基因重组表达仍属空白。因此，有必要从东方肉座菌EU7-22中克隆GH10木聚糖酶的xynⅢ序列(gxynⅢ)和CDS序列(cxynⅢ)，对其进行生物信息学分析，并利用真核表达技术构建xynⅢ的毕赤酵母重组表达菌株，以实现其胞外分泌高效表达，从而为进一步研究XYNⅢ的酶学性质以及蛋白工程研究提供基础材料。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂

TaKaRa Ex Taq，genome walking kit，DNA Marker 和pMD19-T 载体均购于宝生物工程(大连)有限公司；胶回收试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司；其他试剂均购于上海生工生物工程技术服务有限公司和国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 菌株及培养基

菌株：东方肉座菌(HypocreaOrientalis)EU7-22，大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α 为本实验室保存。

LB培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，pH值7.2；固体培养基加入2%的琼脂粉。

NN培养基：葡萄糖20 g/L，(NH4)2SO45 g/L，KH2PO415 g/L，MgSO40.6 g/L，CaCl20.6 g/L，FeSO4·7H2O 0.005 g/L，MnSO4·H2O 0.0016 g/L，ZnSO4·7H2O 0.0014 g/L，CoCl20.002 g/L，121℃高压灭菌。

诱导产酶培养基：玉米芯粉20 g/L，麸皮10 g/L，蛋白胨5 g/L，CaCl25 g/L，MgSO45 g/L，KH2PO42.5 g/L，Tween-80 4 mL/L，调pH值至5.5，121℃高压灭菌。

YPD、MD、MM、BMMY培养基见Invitrogen公司的毕赤酵母表达手册。

1.2 实验方法

1.2.1 总DNA提取

将东方肉座菌EU7-22在NN培养基中培养48 h后，过滤收集菌体，按CTAB法提取东方肉座菌EU7-22总DNA[14-15]。

1.2.2 总RNA提取

将东方肉座菌EU7-22固体NN平板活化后，转接至诱导产酶培养基培养36 h，离心收集菌体；菌体用液氮充分研磨后转入1.5 mL无菌离心管中，加入1 mL TRIzol裂解液，混匀至无沉淀后，室温静置5 min；加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡15 s，静置5 min后，12 000 g 4℃离心15 min，收集上清弃沉淀。加入等体积的异丙醇，混匀后室温静置10 min，离心后弃上清液， 沉淀用75%乙醇洗涤后，用DEPC水溶解，-80℃保存备用。

1.2.3xynⅢ部分片段的克隆

根据GenBank中里氏木霉(accession number: AB036796.1)和康宁木霉(accession number: EU360940.1)的GH10木聚糖酶基因的保守区域设计引物Pxyn3-F和Pxyn3-R(表1)，以东方肉座菌基因组DNA为模板克隆xynⅢ的部分序列(PxynⅢ)。PCR反应程序如下：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经过胶回收后连接到pMD19-T载体上，然后转化到E.coliDH5α感受态，先通过氨苄青霉素LB抗性平板筛选，再以M13通用引物对阳性克隆子进行筛选和测序(上海生工)，并将测序结果在NCBI中进行比对。

1.2.4PxynⅢ上游和下游片段克隆

根据TaKaRa的染色体步移试剂盒说明书，结合文献[6]，设计扩增PxynⅢ片段上下游序列的巢氏引物，如表1所示：Pxyn3-U1，Pxyn3-U2，Pxyn3-U3为克隆PxynⅢ上游序列的巢氏引物；Pxyn3-D1，Pxyn3-D2，Pxyn3-D3为克隆PxynⅢ下游序列的巢氏引物。PCR反应体系和PCR反应程序都根据染色体步移试剂盒的说明书来设计。通过3次巢氏PCR得到的PxynⅢ上下游片段分别经过胶回收后连接pMD19-T载体并转化E.coliDH5α感受态，然后通过氨苄青霉素抗性平板筛选，再以M13通用引物对阳性克隆子进行筛选和测序(上海生工)。

1.2.5cxynⅢ的克隆

通过DNAMAN软件分析PxynⅢ及其上下游片段的序列并对其进行拼接，得到包括xynⅢ和其上下游片段的序列，将此序列通过NCBI比对确定gxynⅢ序列。根据gxynⅢ序列设计引物xyn3-F和xyn3-R扩增xynⅢ的CDS序列。PCR的模板是通过PrimeScriptTMII Reverse Transcriptase试剂盒反转录得到的单链cDNA。PCR程序如下：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸80 s，30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经过胶回收后连接pMD19-T载体并转化E.coliDH5α感受态，先通过氨苄青霉素抗性平板筛选，再以M13通用引物对阳性克隆子进行筛选和测序(上海生工)，并将测序结果在NCBI中进行比对。

表1 东方肉座菌木聚糖酶Ⅲ基因克隆引物

注：下划线分别为EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点序列。

1.2.6xynⅢ序列的生物信息学分析

将克隆获得的gxynⅢ序列与cxynⅢ序列用DNAMAN软件分析基因内含子；将gxynⅢ序列与cxynⅢ在GenBank数据库中进行同源性比对(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)；利用SignalP 4.1软件分析N-末端信号肽序列(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；分子进化树的构建使用软件MEGA6.06软件中的Neighbor-Joining法完成；用ProtParam工具分析cxynⅢ编码蛋白质的氨基酸序列组成、相对分子质量、等电点等理化性质(http://web.expasy.org/protparam)；利用NetNGlyc软件进行蛋白质N-糖基化位点预测(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc)；利用Prosite motif search对蛋白质的功能位点进行搜索(http://prosite.expasy.org/)；利用SWISS-Model在线软件预测和模拟蛋白质的三级结构(http://swiss-model.expasy.org/workspace/index.php?)[11, 15]。

1.2.7xynⅢ在毕赤酵母中的表达

根据cxynⅢ(去掉信号肽)的基因序列设计含有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点的引物cxyn3-F/R，利用该引物克隆xynⅢ并构建含有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点的T载体pMD19-T-xynⅢ，具体方法步骤参照1.2.5。将pMD19-T-xynⅢ接种于LA液体培养基扩大培养，大量提取pMD19-T-xynⅢ质粒，用EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切，胶回收目的片段，定向插入到带有高效甲醇诱导启动子AOX的毕赤酵母表达载体pPIC9K上的EcoRⅠ和NotⅠ位点之间，形成重组质粒pPIC9K-xynⅢ。重组质粒均经酶切和测序鉴定。

将重组质粒pPIC9K-xynⅢ用SalⅠ线性化后，电击转化毕赤酵母PichiapastorisGS115感受态细胞后，涂布于缺少组氨酸的MD平板，28℃条件下培养2～3 d至转化子出现。MD平板上长出的转化子用pPIC9K AOX通用引物和cxyn3-F/R引物进行菌落PCR验证。根据扩增出的PCR产物片段的大小就可判断目的基因的插入是否存在。

将PCR验证正确的转化子菌株进行扩大培养后，利用1%甲醇进行诱导表达，每隔24 h取样并测定粗酶液的木聚糖酶活力。

1.2.8 木聚糖酶活性测定

采用改进的DNS法测定[17]木聚糖酶活。取0.2 mL适当稀释的粗酶液于具塞试管中，加入1.8 mL 1%山毛榉木聚糖底物，于50℃下温育10 min后加入3 mL DNS试剂终止反应。沸水浴5 min显色后，冷却至室温，定容，测D540 nm吸光值。同时，以加入0.2 mL离子水代替粗酶液为空白对照。

木聚糖酶活力的定义为：在上述反应条件下，每分钟水解1%木聚糖底物释放1 μmol还原糖所需的酶量为1个酶活力单位(IU)。

2 结果与分析

2.1 木聚糖酶Ⅲ基因部分片段的克隆

以东方肉座菌EU7-22 DNA为模板，利用Pxyn3-F和Pxyn3-R以引物获得的东方肉座菌木聚糖酶Ⅲ基因的部分片段大小约1.2 kb(图1A)，测序后得到的PxynⅢ大小为1216 bp，通过NCBI比对结果分析得到这个基因片段是属于木聚糖酶Ⅲ基因的部分片段。

2.2PxynⅢ上游和下游片段克隆

以引物Pxyn3-U1和genome-walking试剂盒提供的简并引物AP1、AP2、AP3、AP4进行第1次巢氏PCR，然后将产物进行适当稀释后为模板，利用Pxyn3-U2和简并引物AP1、AP2、AP3、AP4进行第2次巢氏PCR，最后以第2次巢氏PCR的产物为模板，利用Pxyn3-U3和简并引物AP1、AP2、AP3、AP4进行第3次巢氏PCR。对3次PCR结果进行电泳分析，发现选择AP2简并引物时能得到PxynⅢ的上游片段，AP2引物和Pxyn3-U1、Pxyn3-U2、Pxyn3-U3 3次巢氏PCR的结果见图1B。从图中可知第3次巢氏PCR得到了相应的条带，胶回收第二泳道的1.2 kb左右的条带，通过测序该得到1203 bp的片段。以引物Pxyn3-D1、Pxyn3-D2、Pxyn3-D3和简并引物AP1、AP2、AP3、AP4克隆PxynⅢ下游序列，实验过程同上游序列的克隆过程。经过3次巢氏PCR后发现下游克隆最适合的简并引物也为AP2，3次巢氏PCR的结果见图1C，从图中可以看出第3次巢氏PCR的产物浓度也很低，胶回收第二泳道的PCR产物(约1.6 kb)进行后续实验，测序得到1654 bp的基因片段。

2.3cxynⅢ的克隆

将PxynⅢ(1216 bp)和染色体步移法得到的PxynⅢ上游序列(1203 bp)和下游序列(1654 bp)通过DNAMAN比对和拼接后得到3923 bp，将此序列通过NCBI比对和DNAMAN等软件分析得到东方肉座菌木聚糖酶Ⅲ在基因组上的长度为1283 bp，其上游序列为1164 bp，下游序列为1476 bp。以引物xyn3-F和xyn3-R从东方肉座菌基因组DNA克隆gxynⅢ序列(图1 D)并从cDNA克隆cxynⅢ序列(图1 E)，其大小分别约为1.2 kb和1.0 kb，测序得到大小分别为1283 bp和1044 bp。之后将cxynⅢ序列信息成功提交到GenBank数据库，登录号为: KP641167。

2.4 木聚糖酶基因序列的生物信息学分析

2.4.1 木聚糖酶基因序列内含子及同源性分析

图1 xynⅢ片段的琼脂糖凝胶电泳

M—DNA Marker； 1—PxynⅢ； 2-4—PxynⅢ上游第1, 2, 3次 PCR； 5-7—PxynⅢ下游第1, 2, 3次PCR; 8—gxynⅢ; 9—cxynⅢ。

总DNA克隆得到的木聚糖酶Ⅲ基因gxynⅢ全长1283 bp，总RNA克隆得到的木聚糖酶Ⅲ基因cxynⅢ全长1044 bp，DNAMAN软件分析得知gxynⅢ基因含有3个内含子，位于515～600 bp、837～926 bp和1129～1191 bp处，3个内含子都符合GT-AG规则。利用Primer Premier 5.0将cxynⅢ翻译成相应氨基酸序列(命名为XYNⅢ)并利用NCBI中的Protein blast分析，结果显示：cxynⅢ编码的蛋白质属于糖苷水解酶(GH) 10家族，与拟康氏木霉Trichodermapseudokoningii内切木聚糖酶(Accession：ABY71931.1)氨基酸序列同源性最高，达到98%。选择与XYNⅢ同源性大于60%以上的21个木聚糖酶和3个糖苷水解酶11家族的木聚糖酶，使用MEGA6.06软件的NJ法构建包括XYNⅢ在内的25个酶的系统进化树(图2)。从图2中可以看出，XYNⅢ与拟康氏木霉Trichodermapseudokoningii内切木聚糖酶进化上最接近，其次是里氏木霉的木聚糖酶(Accession: XP 006962419.1)，与其他木霉的GH10家族的木聚糖酶都在同一个分支，说明XYNⅢ是木霉属的GH10家族木聚糖酶。

2.4.2 信号肽分析

用SignalP 4.1软件分析cxynⅢ编码的氨基酸序列XYNⅢ，结果显示：该酶蛋白含有一个信号肽，由N-末端的前1～16个氨基酸(MKANAILCLLAPLIAA)组成。由此推测，东方肉座菌EU7-22 XYNⅢ的成熟蛋白有331个氨基酸。

图2 木聚糖酶Ⅲ基因的系统进化树分析

注：使用MEG6.06软件以Neighbor-Joining法构建25个木聚糖酶氨基酸序列的系统进化树，节点的数值代表步长值。

2.4.3 基本理化性质分析

ProtParam分析表明，东方肉座菌EU7-22 XYNⅢ (去掉信号肽) 有331个氨基酸，该蛋白理论相对分子质量为 36.55 ku，等电点pI为6.14。负荷残基总数(Asp+Glu) 为33，正电荷残基总数(Arg+Lys)为31，分子式为C1624H2551N459O497S3，原子总数为5134；脂肪系数为92.24，Grand average of hydropathicity (GRAVY)亲水性评估为-0.320，为亲水性蛋白。

2.4.4 糖基化分析

NetNGly分析显示，东方肉座菌EU7-22 XYNⅢ酶蛋白可能含有18个N-糖基化位点(N4VIL、N34LTE、N77AAI、N92SMK、N101NQG、N102QGQ 、N107WGD、N116FAQ、N121GKL、N141NIN、N142INN、N144NAD、N145ADT、N175EIF、N179EDG、N217DYN、N220LDS、N230GLK、N291DYT、N302VSK、N325PLL、N332FNP、N334PKP和N340SIV)，见图3。

图3 XYNⅢ酶蛋白N-糖基化位点分析

注：Threshold=0.5，为N糖基化位点的临界值，数值超过0.5可能为糖基化位点，数值越高，引起N糖基化的可能性越大。

2.4.5 蛋白Prosite motif search分析及三级结构预测

利用Prosite motif search对蛋白质的功能位点进行分析，分析发现：该XYNⅢ蛋白可能含有2个N-糖基化位点(N18LTE和N286VSK)，8个蛋白激酶C磷酸化位点，3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，5个N-豆蔻酰化位点。

利用SWISS-Model对XYNⅢ蛋白质进行同源建模。通过SWISS-Model在线预测，XYNⅢ与蛋白质数据库(PDB)编号为1K6A(来自Thermoascusaurantiacusxylanase I[18])的相似度为65.89%。以PDB：1K6A为模板序列，预测XYNⅢ第30～331位氨基酸残基的三级结构，α螺旋和β折叠分别标记为红色和黄色，无规则卷曲为白色，得到东方肉座菌EU7-22 XYNⅢ蛋白的三维结构模型(见图4)。该模型含有11个α螺旋，其核心结构为8个β折叠片围成一个柱状结构。

图4 XYNⅢ蛋白的三维结构模拟图

图5 菌落PCR鉴定阳性转化子

M—Protein marker； 1-7—The transformants； 注：1 500左右的条带为与目的基因相关的片段，2 200左右的条带为AOX1基因片段。

2.5xynⅢ在毕赤酵母中的表达

成功构建了pPIC9K-mxynⅢ重组表达质粒，成功地转化进毕赤酵母中，经过MD平板筛选后的转化子利用菌落PCR鉴定，结果如图5。由图5可知，获得了若干株阳性转化子，将这些阳性转化子用G418抗性筛选出高拷贝转化子，高拷贝的转化子再点接于MM平板上进行甲醇利用表型的鉴定。筛选的高拷贝转化子用YPD培养基扩大培养后，用1%甲醇诱导表达，在上清液均检测到木聚糖酶活力。筛选出产木聚糖酶活较高的菌株进行甲醇诱导表达，每隔24 h取样收集到的上清液按照1.2.8所述的方法测定木聚糖酶活性，实验结果(图6)表明：xynⅢ在毕赤酵母中实现了异源高效表达，随着诱导时间的增加，发酵液中的木聚糖酶活也不断增加，在诱导培养168 h后达到了 127.5 IU/mL。

图 6 重组转化子GS115(pPIC9K- mxynⅢ)的诱导产酶曲线

3 讨论

本研究使用染色体步移等基因克隆技术，首次从东方肉座菌EU7-22基因组中克隆得到了GH10家族木聚糖酶的cDNA序列，该序列编码一个由331个氨基酸组成的蛋白，N端包括一个由16个氨基酸组成的信号肽(见图7)。经过生物信息学分析，该基因编码的蛋白酶属于GH10家族木聚糖酶，且与拟康氏木霉内切木聚糖酶有最高的同源性。

在真核微生物中所产的木聚糖酶被糖基化是比较普遍的，通常认为糖基化不仅利于酶抵御极端环境，而且也是木聚糖酶多样性的重要原因之一[2]。预测蛋白的N糖基化和理化性质，对于蛋白的酶学性质测定具有重要的指导作用。如表达的酶蛋白实际分子量大小以及出现多个蛋白条带的原因、酶活性的高低、不同pH值下酶活高低等，可能与酶蛋白的糖基化或理化性质有关。因此，对XYNⅢ进行了N糖基化预测分析和理化性质分析。此外，通过对东方肉座菌XYNⅢ蛋白功能位点预测以及蛋白三级结构模拟，不仅有利于对xynⅢ和XYNⅢ的进一步了解，而且为今后构建具有高催化活性的酶蛋白突变体提供依据[19]。在此基础上，本研究首次成功地对东方肉座菌GH10家族木聚糖酶基因xynⅢ进行了克隆以及实现了其在毕赤酵母中的高效表达，为XYNⅢ的蛋白功能研究奠定了基础。获得该酶的酶学性质是该酶大规模生产及应用的前提，因此，该酶的酶学性质以及一些潜在的特性有待进一步研究。

图7 xynⅢ cDNA序列和氨基酸序列

注：带有下划线的表示起始密码子和终止密码子；带有方框的表示信号肽序列。

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WU Jin-lian， XUE Yong， LI Hai-long， LIU Jian， GAN Li-hui， LONG Min-nan

(College of Energy, Xiamen University, Xiamen 361102, China)

Endo-1,4-xylanase (E.C.3.2.1.8) is the major enzyme to the conversion of hemicelluloses into xylo-oligosaccharide. In this research, a novel GH10 xylanaseⅢ (xynⅢ) gene was cloned fromHypocreaorientalisEU7-22 by chromosome walking and PCR. The results showed that the DNA fragment (1283 bp) encodingxynⅢ (gxynⅢ) contained three introns. The CDS ofxynⅢ (cxynⅢ) encoded 331 amino acids of putative mature protein and a 16 aa signal in N terminator. The amino acid sequence ofxynⅢ is highly homologous with the endoxylanase ofTrichodermapseudokoningii. The bioinformatics analysis showed that the theoretical isoelectric point and the molecular weight of putative mature protein of XYNⅢ were 6.14 and 36.55 ku, respectively. It is a soluble hydrophilic protein containing 18 N-glycosylation sites. The 3D structure predicted with SWISS-Model showed that XYNⅢ protein contained 11 alpha helices and 8 extended strands. A recombinant plasmid pPIC9K-xynⅢ was constructed and then transformed intoPichiapastoris. The transformant identified by PCR was induced to produce XYNⅢ enzyme with 1% methanol. And after 168 hours induced expression, the produced crude enzyme was detected to reach a high enzymatic activity of 127.5 IU/mL.

Hypocreaorientalis; xylanase Ⅲ; gene clone; bioinformatics analysis; heterologous expression

2015-02-05；

2015-02-25

国家自然科学基金(21303142，31170067)；福建省海洋高新产业发展专项项目(闽海洋高新[2014] 25号)；厦门市海洋经济发展专项资金项目(14GZP59HJ29)

吴金连，硕士，研究方向为生物能源，E-mail：jinlwu@foxmail.com；薛 勇，博士，研究方向为生物能源，E-mail：lxylinyu@163.com；吴金连和薛勇为共同第一作者；

龙敏南，博士，研究方向为生物质资源利用，E-mail: longmn@xmu.edu.cn。

Q786

A

2095-1736(2015)05-0001-06

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.05.001