HPLC同时测定复方归枳颗粒中四种成分的含量

2015-03-22李青松郎永英毛春芹陆兔林

陕西中医 2015年1期

关键词：枳壳橙皮乙腈

李青松黄阳郎永英毛春芹陆兔林 ▲

江苏省昆山市中医院 (昆山 215300)

HPLC同时测定复方归枳颗粒中四种成分的含量

李青松黄阳郎永英△毛春芹△陆兔林△ ▲

江苏省昆山市中医院 (昆山 215300)

目的：建立同时测定复方归枳颗粒中阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷4种成分的反相高效液相色谱法。方法：采用高效液相色谱法(HPLC)。色谱条件：Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm， 5 μm)；流动相：乙腈-甲醇-0.1%磷酸水溶液。流速：1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长218 nm。结果：阿魏酸在0.0125～0.0642 mg/mL、柚皮苷在0.0801～0.4005 mg/mL、橙皮苷在0.0352～0.1760 mg/mL、新橙皮苷在0.0848～0.4240 mg/mL范围内均成良好的线性关系；相关系数分别为0.9995、0.9998、0.9996、0.9997；平均回收率分别为100.15%、97.70%、99.05%、97.75%，RSD分别为1.97%、2.05%、2.57%、1.34%。结论：该方法简便、准确、重现性好，可作为该颗粒制剂的质量控制方法。

复方归枳颗粒为医院复方中药制剂，由当归、枳壳、山茱萸、续断、诃子5味药制成，具有补血养血，调经止痛之功效，现临床较多用于女性血虚经闭、月经不调、痛经等症，均取得良好的治疗效果，达到了标本兼治。当归是方中君药，有补血调血之效，主要有效成分为阿魏酸；配枳壳以益气养血，气血同调，益冲任之脉，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等黄酮类成分是其主要药效成分[1-4]。通常含量测定只测复方中的一种成分，不能全面反映复方质量，并且未见报道同时测定本方多种有效成分含量的文献[5]。为了提高本品的内在质量标准，本文建立了高效液相色谱法(HPLC)同时测定复方归枳颗粒中橙皮苷、阿魏酸、柚皮苷、新橙皮苷的含量，分离效果理想，方法灵敏但稳定，现报道如下。

1 仪器与试药 1.1 仪器采用配有VWD可变波长检测器的Agilent 1100 高效液相色谱仪，应用色谱工作站为Chem Station ；由淮阴汉邦科技有限公司生产的Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；由梅特勒-托利多公司生产的MS105DU型电子分析天平；由昆山市超声仪器有限公司生产的KQ-600DB型超声波清洗器。

1.2 试药复方归枳颗粒(医院自制，规格：10 g/袋，批号为140302、140304、140306)；对照品均购自中国药品生物制品检定所，分别为阿魏酸(批号0773-9708)、柚皮苷(批号110722-200610)、橙皮苷(批号110721-200211)、新橙皮苷(批号110721-200206)；所用试剂乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他均为分析纯。

2 方法与结果 2.1 色谱方法色谱柱：Kromasil C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-甲醇-0.1%磷酸水溶液；检测波长218nm；流速：1.0mL/min；柱温30℃；进样量10 μL[5-7]。

2.2 制备对照品的混合液分别精密称取橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、阿魏酸对照品适量，置于50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，分别制成浓度为每1mL含橙皮苷0.669mg、柚皮苷1.802mg、新橙皮苷1.218mg、阿魏酸1.278mg的对照品储备液。再分别精密吸取适量上述溶液置于容量瓶中5mL，加甲醇稀释至刻度，即得对照品混合液(分别为阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷为64.4μg/mL、396.0μg/mL、168μg/mL、404μg/mL)。

2.3 供试品溶液的制备取本品约2.5 g，精密称定，置于50 mL容量瓶中，加入甲醇20 mL，称重；超声处理20 min，放冷至室温，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，滤液用微孔滤膜过滤，即得。

2.4 阴性对照液的制备按照归枳颗粒的处方及制备工艺，制成不含当归、枳壳的样品。方法同上制成缺当归、枳壳的阴性样品溶液。

2.5 阴性对照试验分别精密吸取对照品混合液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL，在上述色谱条件下进样；结果表明，供试品溶液中被测组分与其它成分分离良好，缺当归、枳壳的阴性对照品无干扰峰。见图1。

1.阿魏酸 2.柚皮苷 3.橙皮苷 4.新橙皮苷A.对照品混合液 B.供试品溶液 C.阴性对照溶液图1 高效液相色谱图

2.6 线性关系考察分别精密量取对照品混合液0.2 mL、0.4 mL、0.5 mL 、0.6 mL、0.8 mL～1 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，混合对照品母液单独为一组；分别精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，同时记录并计算峰面积。对数据进行回归分析，将进样浓度x(mg/mL)设为横坐标，将峰面积y设为纵

坐标。分别求得阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷标准曲线方程、相关系数和线性范围，结果见表1。

表1 四种有效成分的线性方程、相关系数及线性范围

2.7 精密度试验每次取对照品混合液10 μL，连续进样6次，测得阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的峰面积并计算，RSD分别为1.18 %，1.92 %，2.33%，1.66 %。

2.8 稳定性试验取批号为130302的供试品溶液，每隔2h进样一次，共6次，结果阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷峰面积的RSD分别为2.51%、0.66%、1.09%、0.82%、表明样品溶液在12 h内稳定。

2.9 重复性试验取批号为130302的供试品溶液，按文中色谱条件测定6次，阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的平均含量分别为0.1170 mg/g、2.864 mg/g、0.4422 mg/g、2.1287 mg/g；RSD分别为2.70%、1.60%、2.64%、1.89%，表明该法具有良好的重现性。

2.10 加样回收率分别精密称取阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷对照品适量，置于同一量瓶中，分别制成质量浓度为0.1685 mg/mL、3.5677 mg/mL、0.5147 mg/mL、2.5263 mg/mL的对照品混合液。取已知含量的批号为140302的样品9份，每份约1.25 g，置具塞锥形瓶中，分别加入对照品混合液0.8 mL、1 mL、1.2 mL，按样品测定项下方法测定，计算各自回收率。阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的平均加样回收率依次为100.15%、97.70%、99.05%、97.75%，RSD分别为1.97%、2.05%、2.57%、1.34%。

2.11 样品测定分别取批号为140302 、140304、 140306的样品，精密称取约2.5 g制成供试品溶液，再取供试品溶液和对照品溶液各10 μL，照上述色谱条件测定，计算，结果见表2。

表2 归枳颗粒样品含量测定结果

3 讨论复方归枳颗粒为我院多年临床经验方，具有养血补血、调经止痛等疗效，原医院制剂质量标准中只有阿魏酸含量的简单测定项，但作为中药复方制剂，单一成分并不能很好控制其质量，因此，本文采用HPLC法同时测定制剂中阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷4种成分的含量，为复方归枳颗粒质量标准的制订提供科学依据，确定合理检测限度[8-9]。

由于复方归枳颗粒成分复杂，其主要有效成分的紫外吸收差异很大；我们为对混合对照品进行了吸收光谱扫描以保证分离、检测的良好性。通过与单一对照品比较，除阿魏酸峰外，其他检测成分的峰在310nm处灵敏度均大幅降，且在210 nm处基线不稳定，只有在218 nm处各种被测组分都能出峰，低含量组分中阿魏酸的分离度适中且检测灵敏度、峰型也较好[8]。分析认为，将218 nm作为检测波长，才能实现吸收强、干扰小的目的。

为了保证样品中检测成分能被充分提取，查阅文献，对同一批样品分别进行了提取溶剂(甲醇、乙醇)、方法(超声提取、回流提取)、时间选择试验(20、30、40 min)[10-14]。结果发现，甲醇不仅提取效率高，而且供试品进入液相杂质干扰少；超声提取与回流提取方法，以及提取时间对提取率均无显著差异。综合考虑提取率、成本等因素，选定加甲醇适量，超声30min。

经过甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸水、乙腈-甲醇-磷酸水溶液等4种流动相系统试验，发现只有乙腈-甲醇-磷酸水溶液作为流动性时，基线平稳度好，待测化合物灵敏度也更高，尤其是阿魏酸的峰型好，其余各峰分离效果也较佳，分离度均达到1.5以上，故选择乙腈-甲醇- 0.1 %磷酸水梯度为流动相进行洗脱，但注意在测定过程中要保持其稳定。

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