高效液相色谱法测定复方黄芪颗粒中黄芪苷的含量

冒有平 江苏省如皋市中医院药剂科(如皋 226500)

高效液相色谱法测定复方黄芪颗粒中黄芪苷的含量

冒有平 江苏省如皋市中医院药剂科(如皋 226500)

目的：探讨高效液相色谱法测定复方黄芪颗粒中黄芪苷的含量。方法：色谱条件：流动相为甲醇-水-乙腈，流速为1mL/min，紫外检测波长为250nm，进样量10μL，柱温35℃。结果：标准曲线方程为Y=013.614X-1.4897，相关系数R=0.9979；本实验方法精密度符合要求，回收率高，稳定性强，黄芪苷在24h内稳定性良好，高效液相色谱法测定复方黄芪颗粒中黄芪苷的含量为3.39mg/5g。结论：高效液相色谱法测定复方黄芪颗粒中黄芪苷的含量操作简便迅速，精密度和稳定性均较理想，回收含量高，可为测定中药中黄芪苷物质含量提供方法依据。

复方黄芪颗粒是临床上的常用药，具有健脾益肾，疏肝活血，清热利湿之功效。黄芪苷是复方黄芪颗粒中主要活性物质之一[1]。黄芪苷具有降压、镇惊、镇痛作用，能增加血浆中cAMP和再生肝DNA的含量[2]；也能促进胰岛素的分泌，激活延长小鼠腹腔巨噬细胞的生长，促进炎症反应的消失[3]。众所周知，在当前我国药物的发展进程中，中药质量标准化的研究是指导临床合理用药和保证中药材质量的主要手段[4-5]。同时我国传统医学强调的是中药的整体效应，对单个成分的作用机制研究较少[6]。由于黄芪苷具有显著的生物活性，因此高效测量黄芪苷的含量工艺有重要的意义[7]。当前黄芪苷的测定方法有薄层色谱法(TLC)、毛细管电泳法(CZE)等，不过上述方法在含量测定中都普遍存在灵敏度不高、重复性不强的现象[8]。高效液相色谱在当前生物样品的测定中具有灵敏、快速、分辨率高、重复性好等优点。本文具体探讨了高效液相色谱法测定复方黄芪颗粒中黄芪苷的含量价值，现报告如下。

1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 复方黄芪颗粒(四川百利药业有限责任公司，国药准字Z20003380)，对照品本均来自本实验组从复方黄芪颗粒中分离得到的黄芪苷，分析纯甲醇来自北京化工试剂公司，分析乙腈来自Sigma公司。高效液相色谱(HPLC)选择Waters 2695，配套有UV waters 2996检测器，色谱柱为SUNFIRE C18(5μm 4.8×150mm)，KQ-700DB超声波清洗器来自昆山市超声仪器有限公司，FTIR-8400S型红外光谱仪与GSP-84-02型磁力恒温搅拌器都来自岛津公司。

1.2 色谱条件 流动相：甲醇-水-乙腈；流速：1mL/min；紫外检测波长：250nm；进样量：10μL；柱温：35℃。黄芪苷纯品HPLC色谱图见图1。

图1 黄芪苷纯品HPLC色谱图

1.3 对照品的制备 精密称取黄芪苷标准品20mg，分别精确配成0.4mg/mL、0.8mg/mL，1.2 mg/mL，1.6 mg/mL，2.0 mg/mL的溶液，摇匀，分别经0.45μm微孔滤膜过滤，备用。

1.4 供试品的制备 取复方黄芪颗粒200g，分别用1500mL甲醇浸泡过夜回流提取，分离得到复方黄芪颗粒粗提物5g，甲醇溶解，选择二氯甲烷甲醇10：1(200 mL)和4：1(400 mL)洗脱，提取后溶于50mL甲醇作为黄芪苷的供试品。

1.5 标准曲线的制作 分别精密吸取0.15 mL，0.30 mL，0.45 mL，0.60 mL标准品溶液，各加入无水乙醇定容至0.75 mL，置于冰浴中加入7.5 mL体积分数为72%的硫酸摇匀，在30min内，于波长250nm处测定吸光度，所求得标准曲线方程为Y=013.614X-1.4897，相关系数R=0.9979，线性范围为10.2-102μg/ mL-1，表明线性回归较好。

2 结 果 2.1 精密度试验 取已配好的对照品黄芪苷溶液重复进样6次，进样量为5μL，记录各峰面积，计算RSD值分别为1.6%、1.7%、1.8%、1.6%，1.1%和1.7%，表明本实验方法精密度符合要求。

2.2 稳定性实验 取复方黄芪颗粒的粗提物溶解，在0、4、12、24h测定，进样量为5μL，测得蒙古黄芪的黄芪苷RSD值为0.263%、0.265%，0.263%，0.266%，结果表明黄芪苷在24h内稳定性良好。

2.3 加样回收率 在加样回收率实验中，我们取复方黄芪颗粒粗提物2.00g，分别加入黄芪苷0mg、0.50mg、1.00mg，甲醇溶解过滤，母液上硅胶柱色谱，分选择二氯甲烷甲醇10：1(200 mL)和4：1(400 mL)洗脱，然后继续进行微孔过滤，进样量为5μL。各个实验重复3次，取峰面积的平均值，结果见表1，表明其回收率高，稳定性强。

表1 黄芪苷的加样回收率

2.4 样品含量 我们选择复方黄芪颗粒的供试品溶液进样10μL测定黄芪苷的含量，结果显示黄芪含量为3.39mg/5g。见表2。

表2 复方黄芪颗粒的黄芪苷含量

3 讨 论 黄芪是豆科黄芪属植物，祖国医学认为黄芪性甘，微温，归肺，脾经，具有敛疮生肌、利尿托毒、补气固表之功效[9]。在具体的药学机制上，黄芪对正常机体的抗体生成功能有明显促进作用。黄芪作为常用的抗衰老中药，可显著提高老年大鼠的血浆皮质醇含量[10]。黄芪合剂具有明显的抗疲劳作用，能增强心肌收缩力，改善心脏功能。复方黄芪颗粒是当前在临床上应用的一种常见药物，该药的功能主治为益气、活血、熄风、通络。并且剂型携带、服用方便，当前应用有较高的抗乙肝病毒活性。现代研究表明研究发现复方黄芪颗粒中含有的黄芪苷等化合物具有较强的生物活性，具有正性肌力作用及缺血性脑损伤保护作用及抗炎作用。

色谱法是近代发展起来的一种物理及物理化学的分离分析方法，其药物化学成分分析的色谱方法包括薄层色谱、高效液相色谱、高速逆流色谱气相色谱、超临界流体色谱等。

本文采用高效液相色测定了复方黄芪颗粒中黄芪苷的含量，结果显示色谱回归曲线为Y=013.614X-1.4897，相关系数R=0.9979，线性范围为10.2-102μg/ mL-1，表明线性回较好。同时分析结果表现本实验方法精密度符合要求，黄芪苷在24h内稳定性良好，为复方黄芪颗粒中黄芪苷的含量评价提供了一定的依据。

当前随着分离提取、结构鉴定技术的发展，复方黄芪颗粒已经分离了多种三萜皂苷类化合物，显示其化学成分复杂，对于有效物质的提取与色谱分析要求更高[9]。我们在色谱分析中，建立的体系为流动相：甲醇-水-乙腈；流速：1mL/min；紫外检测波长：250nm；进样量：10μL；柱温：35℃。结果显示其回收率高，稳定性强，黄芪含量为3.39mg/5g。同时复方黄芪颗粒中生物活性成分多样，单一活性成分的含量不能够反应黄芪的生物活性的全貌，还需要我们在下一部工作中进行多活性组分含量测定，使充分发挥其药用价值，具有重要意义[11]。

[1] 杨 莉.复方黄芪颗粒联合拉米夫定治疗慢性乙型病毒性肝炎临床研究[J].中医学报，2013，28(4)：579-580.

[2] 韦尉元，吴 琨，王晓通，等.Cdx2-RNA基因沉默转染胃癌MGC-803细胞对中药人参黄芪复方药物敏感性的影响[J].广东医学，2013，34(7)：994-998.

[3] Huang X， Tang L， Wang F， et al. Astragaloside IV attenuates allergic inflammation by regulation Th1/Th2 cytokine and enhancement CD4+CD25+Foxp3 T cells in ovalbumin-induced asthma[J].Immunobiology，2014，219(7)：565-571.

[4] 张 彤，黄顺旺.HPLC-ELSD测定前列舒乐颗粒中黄芪甲苷[J].中国实验方剂学杂志，2011，17(7)：118-120.

[5] 杜宏伟，梁建强，李 鹏 . 高效液相色谱法测定槐角丸中新橙皮苷含量[J].陕西中医，2013， 34(2)：99-101.

[6] Si YC， Li Q， Xie CE， et al. Chinese herbs and their active ingredients for activating xue (blood) promote the proliferation and differentiation of neural stem cells and mesenchymal stem cells[J].Chin Med，2014，9(1)：13-14.

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[8] 郭春晓，王世宽．高新技术在天然产物有效成分分离中的应用[J]．化学与生物工程，2006，23(5)：39-41．

[9] Sun L， Li W， Li W， et al. Astragaloside IV prevents damage to human mesangial cells through the inhibition of the NADPH oxidase/ROS/Akt/NFκB pathway under high glucose conditions[J]．Int J Mol Med，2014，34(1)：167-167.

[10] 景 鹏，梁 晓，高亚妮，等.益髓颗粒中黄芪甲苷的含量测定研究[J]．陕西中医，2014，2(11)：230-231.

[11] 崔春利，王 梅，郭东艳，等.HPLC-ELSD测定芪黄颗粒中的黄芪甲苷[J]．陕西中医，2013，34(2)：236-237.

(收稿2014-08-16；修回2014-09-21)

黄芪苷/分析 色谱法，高压液相 @复方黄芪颗粒

R284

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.01.051