牛α0干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及抗病毒活性鉴定

彭统全，邵建伟，张润祥，曹 翀，马 波，高明春，王君伟

(东北农业大学 动物医学学院，哈尔滨 150030)

牛α0干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及抗病毒活性鉴定

彭统全，邵建伟，张润祥，曹 翀，马 波，高明春*，王君伟*

(东北农业大学 动物医学学院，哈尔滨 150030)

克隆牛α0干扰素(BoIFN-α0)成熟肽基因，使其在真核细胞中表达，并研究其表达蛋白质的活性。通过PCR方法扩增得到BoIFN-α0成熟肽基因，然后将其连接到含分泌信号肽序列的Pichiapastoris表达载体 pPICZαA 上，构建重组质粒pPICZαA-BoIFN-α0，重组质粒经PmeⅠ酶切线性化后电转化宿主菌GS115。转化子经100 μg·mL-1zeocinTM筛选和PCR鉴定，阳性重组菌经甲醇诱导后实现了BoIFN-α0在毕赤酵母系统中的分泌表达。结果表明：SDS-PAGE和Western blot结果显示表达产物相对分子质量约为18 和21 ku，推测表达产物发生了一定程度的糖基化。细胞病变抑制试验结果表明，重组BoIFN-α0具有较高的抗病毒活性，达到5.72×106U·mg-1。这些研究结果为牛IFN-α的更深层次应用奠定了基础。

牛BoIFN-α0亚型;巴斯德毕赤酵母;分泌表达；抗病毒活性

α干扰素(interferon-α，IFN-α) 属于Ⅰ型干扰素，是迄今发现的最大的一个干扰素基因家族，具有抑制病毒增殖、抗肿瘤以及加强NK细胞杀伤病原感染细胞的能力[1- 2]。1996年P.J.Chaplin等从病毒感染的牛肠上皮细胞中克隆出BoIFN-α[3]，牛IFN-α(BoIFN-α)多基因家族至少由10～12个亚型基因组成，亚型之间同源性很高。已报道的牛IFN-α A、B、C、D、E、F、G、H八个亚型核苷酸相似性在93.6%～97.2%，氨基酸相似性在91.0%～95.2%，核苷酸和氨基酸相似性均超过了90%以上。牛IFN-α和人IFN-α、鼠IFN-α氨基酸序列相似性分别为65%和57%。不同亚型可能是由不同细胞或同一细胞在不同时期分泌的，但由于缺乏系统的对比研究，其生物学活性是否有差异目前还不清楚[4]。作者根据牛IFN-α基因在牛8号染色体上的序列位置，命名本研究的干扰素α亚型为IFN-α0(GenBank：NM_174085)。牛α干扰素蛋白是由567个核苷酸编码一个开放阅读框(ORF)，其中23个氨基酸编码其信号肽，166个氨基酸组成其成熟多肽。BoIFN-α0核苷酸与已知的牛α干扰素亚型相似性均在94%以上，最高为96.14%，最低为94.56%。BoIFN-α0成熟肽由166个氨基酸组成，YinOYang 1.2Server预测含有4个O-糖基化位点，无N-糖基化位点；Arg-33、Tyr-123为保守残基，29—35、123—140为保守区域，Cys1-Cys99和Cys29-Cys139组成两个二硫键；二级结构主要由A～E 5个α-螺旋组成。毕赤酵母表达系统是最近二十年发展起来的一种成熟的真核表达系统，是高效表达外源蛋白质的理想系统[5]。研究表明，重组BoIFN-α在体外具有抗多种病毒的作用和多种免疫调节功能[6-10]。本研究实现了重组牛IFN-α0亚基因在毕赤酵母中的高效表达，并对其表达产物进行了抗病毒活性研究，本研究为新型抗病毒制剂的研制与临床应用准备了基础材料。

1 材料与方法

1.1 菌株 、载体和试剂

酵母表达所用质粒pPICZα-A 载体和菌株GS115购自美国Invitrogen公司。大肠杆菌DH5α、水泡性口炎病毒(VSV)为本实验室保存。蛋白质Marker购自Fermentas公司；限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司；zeocinTM为Invitrongen公司产品，生物素购自华美生物工程公司，其他试剂均为国产或进口分析纯。牛肾细胞(MDBK)由本实验室保存；DMEM培养基为Invitrogen公司产品；胎牛血清购自天津灏阳公司。毕赤酵母专用培养基BMMY、BMGY、YPD等参考Invitrogen公司毕赤酵母培养基说明书配制。

1.2 重组质粒pPICZαA-BoIFN-α0的构建

PCR扩增的牛α0干扰素基因胶回收产物和表达载体pPICZα-A用XhoⅠ和EcoRⅠ进行双酶切按3∶1的摩尔比混匀，16 ℃ 连接过夜，转化氯化钙法制备的 DH5α感受态大肠杆菌。挑取低盐 LB 平板上的 zeocin抗性菌落，提质粒，用XhoⅠ和EcoRⅠ进行双酶切鉴定和测序验证，将获得的阳性重组质粒命名为pPICZαA-BoIFN-α0。

1.3 电转及筛选

将重组质粒pPICZαA-BoIFN-α0以PmeⅠ酶切线性化。按照毕赤酵母表达说明书制备GS115感受态，取85 μL，与7 μLPmeⅠ单酶切线性化的重组质粒混匀，然后转移到冰预冷的0.2 cm的电转化杯中，把电转化杯在冰上放置5 min后再在电穿孔仪上用脉冲电流电击一次，电击条件：电压1 500 V，电容 25 μF，电阻 200 Ψ ，温度 0 ℃。电击结束，立即加入 1 mL冰预冷的 1 mol·L-1山梨醇，轻轻混匀，把电转化杯放入 30 ℃ 温育1 h左右， 加入1 mL YPD培养基至1.5 mL EP管中，30 ℃ 180 r·min-11 h，取400 μL菌液涂在含有 100 μg· mL-1zeocin抗生素的 YPDS固体培养基平板上，置 30 ℃ 恒温培养 2～4 d，挑取典型菌落，接种于YPD培养基中，30 ℃，220 r·min-1振荡培养36 h。

1.4 转化子的PCR检测

按照文献[11]介绍的煮沸法提取酵母基因组，用醇氧化酶(AOX1) 基因特异引物和目的片段的特异性引物鉴定牛α干扰素基因是否插入AOX1 启动子部位。扩增程序 ：94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s、60 ℃ 50 s、72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10 min。 扩增结束，取 3 μL反应液做琼脂糖电泳观察。如果是阳性重组酵母菌株，通过上述引物对扩增的片段为1 080 bp左右 。用目的片段的特异性引物鉴定，扩增的片段长度应为500 bp 左右。

1.5 酵母重组子的诱导表达

挑取阳性转化子于BMGY培养基中培养至 OD600 nm为 2～6，4 ℃，3 500 r·min-1离心5 min，加BMMY培养基悬浮至OD600 nm为1，转至挡板三角摇瓶，30 ℃，220 r·min-1培养96 h，每隔24 h添加甲醇至终体积分数为1%，以保持诱导的持续表达。

1.6 表达产物的处理和Western blot检测

将发酵液 5 000 r·min-1，4 ℃离心 15 min，取上清经60%硫酸铵浓缩，沉淀用PBS重悬，PBS透析后经BCA蛋白检测试剂盒检测分泌蛋白质的蛋白质质量浓度。用0.22 μm滤膜过滤上清，用于蛋白质抗病毒活性鉴定。参照《分子克隆实验方法指南》(第3版)进行Western blot检测。对表达的蛋白质按常规方法进行SDS-PAGE，转印至醋酸纤维素膜上，0.05 g·mL-1脱脂乳4 ℃封闭过夜，PBST洗膜3次，一抗为本实验室制备的兔源抗BoIFN-α多抗血清(免疫原为本实验室表达纯化后的BoIFN-α A亚型蛋白)，37 °C恒温摇床80 r·min-1作用1 h；二抗为HRP标记羊抗兔IgG，37 ℃恒温摇床80 r·min-1作用1 h，PBST洗膜3次，经4-CN显色出现反应条带后，去离子水冲洗终止反应，观察结果。

1.7 表达产物的抗病毒活性测定

用96孔细胞培养板常规培养MDBK细胞至单层后每孔加入100 μL 4倍倍比稀释的BoIFN-α0，37 ℃孵育24 h后用100 TCID50VSV攻毒48 h后观察细胞病变的抑制结果，同时设细胞对照和病毒对照。以抑制50%细胞病变(CPE50)的最高干扰素稀释度为1个活性单位(U)。

2 结 果

2.1 目的基因的扩增和重组质粒的构建

扩增BoIFN-α0，获得大小约为500 bp的目的片段(图1) 将BoIFN-α0基因克隆至载体pPICZαA中，获得重组质粒pPICZαA-BoIFN-α0，并进行酶切和测序验证，酶切结果如图1B，EcoRⅠ单酶切片段大小为4 100 bp左右，EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切一条带大小3 600 bp，另一条带大小500 bp左右。测序结果表明目的序列与Bos taurus IFN-alpha C(IFNAC，GenBank：NM_174085)相似性达到99%，pPICZαA- BoIFN-α0构建正确。

2.2 含BoIFN-α0基因的重组酵母菌株的鉴定

通过AOX1基因特异性引物对和目的片段特异性引物做PCR鉴定，以重组BoIFN-α0基因的酵母菌株染色体为模板，分别扩增出现1 080 bp(图2A)的条带和500 bp(图2B)左右的条带 。

M1.Trans2K DNA相对分子质量标准；1.BoIFN-α0的PCR产物；M2.Trans2K PlusΠ DNA相对分子质量标准；2.pPICZαA- BoIFN-α0的EcoRⅠ酶切产物；3.pPICZαA- BoIFN-α0的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切产物M1.Trans2K DNA marker；1.PCR product of BoIFN-α0；M2.Trans2K PlusΠ DNA marker；2.pPICZαA-BoIFN-α0 digested by EcoRⅠ；3.pPICZαA-BoIFN-α0 digested by EcoRⅠ and XhoⅠ图1 PCR扩增(A)及重组载体pPICZαA- BoIFN-α0的酶切鉴定(B)Fig.1 Electrophoresis of PCR product(A) and restriction enzyme assay of recombinant vector pPICZαA- BoIFN-α0(B)

2.3 阳性重组酵母的诱导表达和Western blot鉴定

通过不同时段取样的电泳分析，发现重组酵母在诱导96 h时的表达量最高，表达产物相对分子质量约为18和21 ku(图3A)，而根据BoIFN-α0成熟肽和C 端融合蛋白的编码基因推导的蛋白质大小为18 ku。其中一条表达蛋白质大小比其推导相对分子质量大3 ku，推测可能是因为表达产物发生了一定程度的糖基化。Western blot结果显示在18和21 ku处可见特异性条带(图3B)，证实均为BoIFN-α0基因表达产物，并且BoIFN-α0为可溶性分泌表达。

2.3 表达产物的抗病毒活性检测

经60%饱和硫酸粗纯后的重组BoIFN-α0用于抗病毒活性鉴定。重组BoIFN-α0 孵育MDBK(100 μL·孔-1)，24 h后接毒VSV，100 TCID50·孔-1，48 h后用显微镜观察细胞病变情况，显示高浓度的重组BoIFN-α0对病毒的抑制作用明显，对细胞的保护率达到100%，但随着稀释度的增加，重组BoIFN-α0对细胞的保护率下降，稀释度达到100×47时对细胞没有保护作用(图4)。结果表明：分泌型BoIFN-α0 具有良好的抗病毒活性，经Reed-Muench法计算，重组BoIFN-α0在MDBK/VSV系统中抗病毒活性为5.72×106U·mg-1。

3 讨 论

IFN-α基因是一类无内含子的多基因家族，主要在病毒感染的外周血白细胞、淋巴瘤细胞或骨髓瘤细胞中表达，从动物体内纯化的IFN-α中发现，有多种序列和性质上存在差异的亚型。在人的基因组中克隆出了12种基因属于IFN-α家族，鼠体内IFN-α编码基因存在14种亚型，其中IFN-α4，IFN-α11，IFN-α12亚型比其他亚型有更高的活性，IFN-α7/10与其他亚型比较活性较低[12]。X.Tan等克隆了大熊猫IFN-α的12个亚型，研究发现IFN-α3/4/8三个亚型比其他亚型有更高的抗病毒活性，比IFN-α6高出四倍。然而IFN-α2/5/7/11的活性比IFN-α6更低[13]。BoIFN-α由567个核苷酸编码1个开放阅读框(ORF)，其中包括 23个氨基酸的信号肽和166个氨基酸的成熟多肽[14]。并且它们之间存在着不同的活性，但各个亚型之间差异性却鲜有报道。毕赤酵母是一种新型的外源基因表达系统，已有多种蛋白质在此系统中高效表达。它是一种甲基营养型酵母 ，在缺乏葡萄糖、甘油等碳源时，可利用甲醇作为唯一碳源而生长。其醇氧化酶(AOX1) 启动子受甲醇的严格控制，可调控外源蛋白质的高效表达。其既具有原核表达系统的高表达量、可大规模培养和成品低廉的优点，又具有真核表达系统可进行蛋白翻译后修饰、加工和折叠等优点[15]。本研究获得的稳定分泌表达重组牛α0干扰素的酵母菌株在 BMMY 培养基中经甲醇诱导发酵96 h后，发酵上清经60%饱和硫酸铵沉淀，PBS透析后用BCA蛋白检测试剂盒测得其质量浓度为1.917 mg·mL-1，比活为5.72×106U·mg-1。而崔子寅、李学仁利用毕赤酵母表达BoIFN-αA、奶牛α干扰素在MDBK/VSV系统抗病毒活性为8.93×106U·mg-1和5.1×106U·mg-1。比较后发现BoIFN-α0抗病毒活性较BoIFN-αA低，略高于奶牛α干扰素，差异不明显，但高于原核表达的牛α干扰素10倍以上[16]。分析其原因，与原核表达系统相比，巴斯德毕赤酵母对分泌的目的蛋白可以进行类似高等真核生物的信号肽的剪切、二硫键形成、糖基化、磷酸化修饰等蛋白质加工过程。而且酵母表达的重组牛α干扰素不需要变性、复性等生产工艺 ，因此更易进行大规模的生产。本研究对发酵上清采用饱和硫酸铵沉淀蛋白质，离心浓缩，PBS透析，尽可能排除培养基长时间发酵对蛋白质活性的影响，也利于蛋白质的保存。目前IFN的研究多以人IFN-α为主，人用重组IFN-α 主要用于抗肿瘤和抗病毒研究，已用于临床[17-18]。市场上已有商品化的重组猪IFN-α和重组犬IFN-α，BoIFN-α研究相对较少[19]，而对BoIFN-α各个亚型抗病毒活性差异的系统研究更少。本研究为以后研究BoIFN-α各个亚型的生物活性差异奠定基础，并对未来研究高效BoIFN-α抗病毒制剂提供物质和理论基础。

A.AOX1扩增；B.BoIFN-α0扩增；M.Trans2K DNA相对分子质量标准；1～5.选择的5株重组酵母的PCR产物A.AOX1 amplification；B.BoIFN-α0 amplification；M.Trans2K DNA marker；1-5.Products of PCR from 5 selected clones图2 PCR鉴定酵母中BoIFN-α0基因Fig.2 Identification of the gene of BoIFN-α0

M.蛋白质分子质量标准；1～5：选择的5株重组酵母的表达产物；6.阳性重组菌的培养上清；7.阴性对照M.Standard protein marker；1-5.Expressed products from 5 selected clones；6.Cultural supernatants of positive strain；7.Negative control图3 表达产物的 SDS-PAGE分析(A)和Western blot检测(B)Fig.3 SDS-PAGE analysis (A) and Western blot (B) Identification of expressed products

横坐标0～11系n分别为0～11时的稀释度0-11 of x axis is the dilutions when n=0-11图4 重组 BoIFN-α0的活性检测Fig.4 Activity assay of recombinant BoIFN-α0

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(编辑 白永平)

Expression of the Bovine Interferon Alpha0 with Antiviral Activity inPichiaPastoris

PENG Tong-quan，SHAO Jian-wei，ZHANG Run-xiang，CAO Chong， MA Bo，GAO Ming-chun*，WANG Jun-wei*

(CollegeofVeterinaryMedicine，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，China)

In this study，we cloned BoIFN-α0 mature peptide gene and expressed it in the eukaryocyte， and also studied the activity of this protein.To achieve secretary expression of bovine interferon-α0 (BoIFN-α0 ) inPichiapastoris，the BoIFN-α0 mature peptide gene was synthesized by PCR and inserted into the secreted expression vector pPICZαA.ThePmeⅠ linearized resultant recombinant plasmid was transformed intoP.pastorisGS115 by electroporation and the positive recombinant strainsP.pastoriswere selected by 100 μg·mL-1of zeocinTMand identified by PCR with the AOX1 primers and the specific primers.The positive recombinant strains were induced with methanol and achieved secretory expression inP.pastorisYeast expression system.The products in culture medium were detected by SDS-PAGE and Western blot.The SDS-PAGE results showed that the recombinant protein was expressed in the supernatant with molecular of 18 and 21 kDa (with the difference of glycosylation).Furthermore，the BoIFN-α0 was able to efficiently inhibiting virus replication in vesicular stomatitis virus (VSV)/MDBK cells detection system and its antiviral activity was about 5.72×106U·mg-1.These results provided a basis for further application of BoIFN-α.

BoIFN-α0；Pichiapastoris；secretory expression；antiviral activity

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.01.016

2014-05-26

现代农业(奶牛)产业技术体系(CARS-37)；国家科技支撑计划项目(2012BAD12B05)；国家科技支撑计划子课题(2012BAD12B03-3)；黑龙江省科技攻关项目(GA09B302)

彭统全(1987-)，男，河南商丘人，硕士生，主要从事兽医微生物与免疫学研究，E-mail:ptqneau@126.com

*通信作者：王君伟，教授，E-mail：jwwang@neau.edu.cn；高明春，E-mail：gaomingchun@163.com

S852.4

A

0366-6964(2015)01-0124-06