壳聚糖-Zn(II)亲和层析介质的制备及表征

张锦捷， 曾庆祝

(广州大学 化学化工学院， 广州 510006)

壳聚糖-Zn(II)亲和层析介质的制备及表征

张锦捷， 曾庆祝

(广州大学 化学化工学院， 广州 510006)

以自制的壳聚糖微球为载体，环氧氯丙烷(ECH)为活化剂，亚氨基二乙酸(IDA)为螯合配基，Zn2+为螯合金属离子制备壳聚糖-Zn(II)亲和层析介质。最佳活化工艺：M壳聚糖(g)∶VECH(mL)为1∶4、NaOH浓度为1.2 mol/L、活化温度为50℃，活化时间为4 h，测得环氧基修饰密度达0.2472 mmol/g；最佳螯合工艺：IDA作为配基、浓度为0.6 mol/L、反应温度为70℃、反应时间为6 h，ZnCl2作为螯合金属盐、浓度为0.1 mol/L、反应时间为3 h，Zn2+螯合量达到最大值。通过红外光谱表征，证明壳聚糖与Zn(II)发生了螯合配位反应，生成了壳聚糖-Zn(II)配合物。

壳聚糖；Zn(II)；壳聚糖-Zn(II)；固定化金属螯合亲和层析(IMAC)

固定化金属螯合亲和层析(Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography, IMAC )是由Porath等[1]于1975年首次提出，利用蛋白质表面暴露的一些氨基酸残基与载体上的金属离子在不同条件下配位键的形成和解离，达到分离纯化效果的技术。某些蛋白质或氨基酸对一些过渡态金属离子如Cu2+、Zn2+和Ni2+等具有包括范德华力、静电作用、共价键等特异亲和力；当这些亲和力强于H2O分子或带负电的阴离子时，蛋白质就会与这些金属离子结合成复合物[2-3]。不同蛋白质对金属离子的亲和能力不同，其关键在于组氨酸、色氨酸和半胱氨酸这一类电子供体氨基酸能与金属离子形成配位复合物[4]。在层析介质上固定不同的金属离子制成金属螯合亲和吸附剂，可选择性地吸附表面裸露有巯基或咪唑基等基团的多肽蛋白，用于层析纯化蛋白质。由于配基简单、吸附量大、交换载量大、分离条件温和及通用性强等特点，IMAC被广泛应用于蛋白质等生物工程产品的分离纯化，逐渐成为最有效的技术之一[5-6]。

壳聚糖是自然界中唯一被发现大量存在的阳离子碱性多糖，其分子中含有氨基、乙酰胺基、羟基等活性基团，因此具有独特的化学性质[7-8]。由于来源丰富，而且具有良好的生物活性、可降解性、可再生性、无毒无害等优越性能，因此广泛应用于各个领域[9]。

锌是人体必需微量元素，是多种酶的成分或酶的激活剂，对机体的生长发育、组织再生、促进食欲、促进性器官和性机能的正常发育、保护皮肤健康、增强免疫功能等多方面都有重要作用。研究已经发现，多肽比氨基酸更易被人体吸收，而且微量元素(锌)可以通过肽转运系统来转运，具有毒性更小、易消化吸收、生物活性高等特殊优点，开发价值较大[10]。

本文以壳聚糖为原料，采用反相悬浮法制备得到颗粒均匀的壳聚糖微球；以环氧氯丙烷为活化剂进行活化，再以活性配基为螯合活性介质与Zn2+进行螯合制备壳聚糖-Zn(II)亲和层析介质；以螯合量为主要参考指标对活化与螯合工艺进行优化，并对制得的壳聚糖-Zn(II)亲和层析介质进行红外光谱分析，为利用该介质分离纯化蛋白质多肽，筛选出适合与Zn(II)螯合的多肽组分奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试剂

壳聚糖(脱乙酰度>90%，上海源聚生物科技有限公司)、冰乙酸、液体石蜡、Span80、乙酸乙酯、戊二醛(50%)、石油醚、NaOH、环氧氯丙烷(ECH)、亚氨基二乙酸(IDA)、乙二胺、氨基三乙酸(NTA)、ZnCl2、ZnSO4、ZnAC2，所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；JJ-6数显六联电动搅拌器 金坛市华欧实验仪器厂；HH-4C数显恒温水浴锅，金坛市鸿科仪器厂；THZ-82水浴恒温振荡器，金坛市华欧实验仪器厂；SHZ循环水式真空泵，河南巩义市英裕豫华仪器厂；PHS-25数显pH计，上海精密科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 壳聚糖-Zn(II)亲和层析介质的合成原理示意图(图1)。

图1 壳聚糖-Zn(II)亲和层析介质的合成原理

1.3.2 壳聚糖-Zn(II)亲和层析介质的制备

1)交联壳聚糖制备。称取一定量的壳聚糖溶解于2%乙酸溶液中，静置排除气泡。在烧杯中分别加入液体石蜡、Span80和乙酸乙酯，搅拌约20 min后，加入上述壳聚糖溶液，升温至55℃，在400 r/min速度下搅拌1 h；缓慢滴加戊二醛(50%)，再用2.5 mol/L的NaOH调节pH值，继续搅拌反应2 h；反应结束后，加入石油醚搅拌5 min，趁热抽滤，用石油醚洗涤后再用蒸馏水反复冲洗，抽干，收集备用。

2)壳聚糖微球的活化。称取一定量上述制得的微球，加入一定浓度的NaOH与环氧氯丙烷，在恒温水浴振荡器中进行活化反应，反应结束后用蒸馏水反复冲洗，直至滤液中无环氧基检出，抽干，收集备用。

3)配基的键合。称取一定量活化后的微球，加入一定浓度的NaOH/配基混合溶液，在恒温水浴振荡器中进行配基键合反应，反应结束后用蒸馏水反复冲洗，抽干，收集备用。

4)金属离子的螯合。称取一定量键合配基后的微球，加入50 mL Zn2+溶液，常温下震荡反应一段时间，反应结束后用蒸馏水反复冲洗，抽干，即得壳聚糖-Zn(II)亲和层析介质。

1.3.3 环氧基修饰密度的定量分析

环氧基修饰密度采用硫代硫酸钠滴定法[11]测定。称取活化后的微球0.5 g于锥形瓶中，加入约5 mL 1.3 mol/L硫代硫酸钠与1～2滴酚酞指示剂，封口后在室温下震荡反应30 min，用0.01 mol/L盐酸标准溶液滴定，根据消耗盐酸标准溶液的体积，由式(1)计算环氧基修饰密度：

(1)

式中：S为环氧基修饰密度(mmol/g)，MHCl为HCl的浓度(mol/L)，V0，Vl为滴定前、后HCl的体积(mL)，W为介质的质量(g)，ρ为介质的密度( g/mL)。

1.3.4 Zn2+螯合量的测定

称取一定量键合配基后的微球，加入50 mL ZnCl2溶液，常温下震荡反应一段时间，反应结束后抽滤，收集滤液并定容，利用原子吸收分光光度计在324.7 nm处测定滤液的吸光值，再根据标准曲线即可计算Zn2+螯合量。

2 结果与分析

2.1 活化条件的考察

2.1.1 ECH用量对环氧基修饰密度的影响

其他条件不变，分别加入M壳聚糖(g)∶VECH(mL)为2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的ECH，结果如图2所示。

由图2可知，随着M壳聚糖(g)∶VECH(mL)的增加，环氧基修饰密度随之增大，当比例为1∶4时，环氧基修饰密度趋于平稳，继续加入ECH，环氧基修饰密度无明显变化。

图2 ECH用量对环氧基修饰密度的影响

2.1.2 NaOH浓度对环氧基修饰密度的影响

其他条件不变，分别加入0.4 mol/L、0.6 mol/L、0.8 mol/L、1.0 mol/L、1.2 mol/L和1.4 mol/L的NaOH进行反应，结果如图3所示。

由图3可知，环氧基修饰密度随着NaOH浓度的增加而增大，在CNaOH=1.2 mol/L达到最大值，继续加大NaOH浓度，环氧基修饰密度降低，可能是由于碱浓度过高导致环氧基断开。

图3 NaOH浓度对环氧基修饰密度的影响

2.1.3 活化温度对环氧基修饰密度的影响

其他条件不变，活化温度分别为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃，结果如图4所示。

图4 活化温度对环氧基修饰密度的影响

由图4可知，活化温度对环氧基修饰密度影响较大，温度过高时环氧基修饰密度下降趋势明显，可能是由于温度过高导致部分环氧基开环；当活化温度为50℃时环氧基修饰密度最大。

2.1.4 活化时间对环氧基修饰密度的影响

其他条件不变，活化时间分别为2 h、3 h、4 h、5 h、6 h和7 h，结果如图5所示。

由图5可知，环氧基修饰密度随着时间的增加先增大后减小，在4 h时达到最大值。这是由于环氧基在碱性条件下会发生开环反应，时间越长开环越严重，导致环氧基修饰密度下降。

图5 活化时间对环氧基修饰密度的影响

Fig 5 Effect of activation time on epoxy group density

综合上述数据确定最佳活化条件为：M壳聚糖(g)∶VECH(mL)为1∶4，NaOH浓度为1.2 mol/L，活化温度为50℃，活化时间为4 h。

按照此最佳活化条件进行验证实验，结果如表1所示，环氧基修饰密度达0.2472 mmol/g。

表1 最佳活化条件下的平行实验

2.2 螯合条件的考察

2.2.1 配基对Zn2+螯合量的影响

其他条件不变，分别与IDA、乙二胺、NTA螯合，结果如图6所示。

图6 不同配基对Zn2+螯合量的影响

由图6可知，与 IDA螯合时Zn2+螯合量最大，因此选择IDA为螯合配基。

2.2.2 IDA浓度对Zn2+螯合量的影响

其他条件不变，IDA浓度分别为0.2 mol/L、0.4 mol/L、0.6 mol/L、0.8 mol/L和1.0 mol/L，结果如图7所示。

由图7可知，随着IDA浓度的增大，Zn2+螯合量先增加后降低，在0.6 mol/L时达到最大值。

图7 IDA浓度对Zn2+螯合量的影响

2.2.3 与IDA反应温度对Zn2+螯合量的影响

其他条件不变，与IDA反应温度分别为40℃、50℃、60℃、70℃和80℃，结果如图8所示。

图8 反应温度对Zn2+螯合量的影响

图9 反应时间对Zn2+螯合量的影响

由图8可知，反应温度对Zn2+螯合量影响不大，但温度大于70℃可能会导致壳聚糖微球表面发生降解，使得Zn2+螯合量降低。

2.2.4 与IDA反应时间对Zn2+螯合量的影响

其他条件不变，与IDA反应时间分别为4 h、5 h、6 h、7 h和8 h，结果如图9所示。

由图9可知，随着与IDA反应时间的增加，Zn2+螯合量先增大后降低，在6 h时达到最大值。

2.2.5 Zn盐对Zn2+螯合量的影响

其他条件不变，分别与ZnCl2、ZnSO4、ZnAC2进行螯合，结果如图10所示。

由图10可知，与ZnCl2进行螯合反应时，Zn2+螯合量最大，因此选择ZnCl2为螯合锌盐。

图10 不同锌盐对Zn2+螯合量的影响

图11 ZnCl2浓度对Zn2+螯合量的影响

2.2.6 ZnCl2浓度对Zn2+螯合量的影响

其他条件不变，ZnCl2浓度分别为0.05 mol/L、0.1 mol/L、0.15 mol/L、0.2 mol/L和0.25 mol/L，结果如图11所示。

由图11可知，随着ZnCl2浓度增大，Zn2+螯合量先增大后趋于平稳，在浓度为0.1 mol/L时，Zn2+螯合量达到最大值。

2.2.7 与ZnCl2螯合时间对Zn2+螯合量的影响

其他条件不变，与ZnCl2螯合时间分别为1 h、2 h、3 h、4 h和5 h，结果如图12所示。

图12 与ZnCl2螯合时间对Zn2+螯合量的影响

由图12可知，与ZnCl2螯合时间对Zn2+螯合量影响不大，反应达到3 h后Zn2+螯合量基本不变，因此选择3 h为最佳螯合时间。

综合上述数据最佳螯合条件为：IDA作为配基、浓度为0.6 mol/L、反应温度为70℃、反应时间为6 h，ZnCl2作为螯合金属盐、浓度为0.1 mol/L、反应时间为3 h，Zn2+螯合量达到最大值。

2.3 壳聚糖-Zn(II)亲和层析介质红外光谱分析

图13 壳聚糖(a)、IDA-壳聚糖(b)、壳聚糖-Zn(II)(c)红外光谱图

由图13壳聚糖(a)、IDA-壳聚糖(b)的红外光谱图可以发现，位于1150 cm-1归属于-OH伸缩振动吸收峰，与IDA键合后移至1108 cm-1，峰值减弱，说明-OH参与了活化与键合配基反应；IDA-壳聚糖(b)的红外光谱图在2930 cm-1处出现一个归属于-COOH的吸收峰，说明产物中引入了-COOH；由IDA-壳聚糖(b)、壳聚糖-Zn(II)(c)的红外光谱图可以发现，位于1598.24 cm-1归属于叔胺的变形振动吸收峰，与Zn(II)螯合配位之后，移至1631.66 cm-1，且波强度减弱，峰形变宽，氨基参与了配位反应，Zn(II)与N原子之间形成了N-Zn(II)配位键；位于1425 cm-1归属于-COOH的伸缩振动吸收峰，与Zn(II)螯合配位之后，吸收峰移至1455 cm-1，且峰值减弱，说明Zn(II)与O原子之间形成了O-Zn(II)配位键。综合以上图谱变化，证明壳聚糖与Zn(II)发生了螯合配位反应，生成了壳聚糖-Zn(II)配合物。

3 结论

以自制的壳聚糖微球为载体、环氧氯丙烷(ECH)为活化剂、亚氨基二乙酸(IDA)为螯合配基、Zn2+为螯合金属离子制备壳聚糖-Zn(II)亲和层析介质，并对亲和层析介质的活化过程以及螯合配基与金属离子过程的工艺参数进行优化，以确定出最优的制备工艺。

1)活化工艺。在1.2 mol/L的NaOH溶液中，加入MRCM(g)∶VECH(mL)为1∶4的环氧氯丙烷，在50℃的恒温水浴中振荡反应4 h，最终环氧基修饰密度可达0.2472 mmol/g。

2)螯合工艺。IDA为螯合配基，浓度为0.6 mol/L，在70℃水浴中震荡反应6 h； ZnCl2为螯合金属盐，浓度为0.1 mol/L，在常温下震荡螯合反应3 h，Zn2+螯合量达到最大。

通过红外光谱表征，证明壳聚糖与Zn(II)发生了螯合配位反应，生成了壳聚糖-Zn(II)配合物。

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Preparation and characterization of chitosan-zinc(II) affinity chromatography medium

ZHANG Jin-jie, ZENG Qing-zhu

(College of Chemical Engineering, Guangzhou University, Guangzhou 510006, China )

The chitosan-zinc(II) affinity chromatography medium chelates with Zn2+using self-made chitosan microspheres as substrate. The iminodiacetic acid(IDA)was attached onto chitosan microspheres activated by epichlorohydrin(ECH). The optimal epoxy density above 0.2472 mmol/g gel was achieved at the proportion of epoxy chloropropane and chitosan microspheres for 1∶4 in the solution consisting of 1.2 mol/LNaOH at 60℃ for 6 h. The study on linkaging of IDA, as ligands, demonstrated that the supporter was synthesized in the solution with 0.6 mol/L IDA at 70℃ for 6 h. When chelating of ZnCl2, as chelating metal salts, synthesized in the solution with 0.1 mol/L ZnCl2for 3 h, the adsorption of Zn2+was up to the maximum. Infrared by IR spectra, the chelating ligand reaction of chitosan and zinc(II) and the generation of the chitosan-zinc (II) complexes were achieved.

chitosan; zinc(II); chitosan-zinc(II); IMAC

2014-06-25；

2014-07-25

广州市科技计划项目(12C12011620)；广州市科信局重大专项(2012Y2-00008)

张锦捷，硕士，研究方向为食品加工副产物的高值化利用；

曾庆祝，教授，研究方向为农副产品加工与应用，E-mail：635642890@qq.com。

Q629.12

B

2095-1736(2015)01-0095-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.01.095