有毒铜绿微囊藻胁迫下三角帆蚌消化系统的扫描电镜观察

袁明哲， 陈 姗， 陈嘉伟， 刘其根， 胡梦红

(上海海洋大学 水产与生命学院， 上海 201306)

有毒铜绿微囊藻胁迫下三角帆蚌消化系统的扫描电镜观察

袁明哲， 陈 姗， 陈嘉伟， 刘其根， 胡梦红

(上海海洋大学 水产与生命学院， 上海 201306)

通过观察暴露于不同浓度有毒铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)下的三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)的胃、前肠、中肠以及晶杆体等消化系统的扫描电镜切片，了解有毒铜绿微囊藻对三角帆蚌消化系统超显微结构的影响。结果显示，当三角帆蚌在浓度为1×107cell/L的有毒铜绿微囊藻环境下，其晶杆体随时间推移而逐渐溶解。在低浓度的铜绿微囊藻环境下，尽管其会继续滤食，但有毒铜绿微囊藻会对其消化系统造成破坏，随着接触时间的增长，造成其肠道内绒毛、纤毛数量减少，长度降低，从而降低其消化效率，对其生长造成影响。

三角帆蚌；消化系统；有毒铜绿微囊藻；扫描电镜

随着环境污染的日益严重，含氮、磷的废水排放量不断增多，水体富营养化问题愈加恶化，导致的藻类爆发式生长，产生有毒藻类水华。水华爆发时，会在水面形成一层蓝绿色湖靛，同时散发出一股腥臭味，不仅使水体含氧量减少导致鱼虾死亡破坏了水生生态系统，更对人和动物的饮用水安全造成威胁。目前世界上淡水湖泊蓝藻水华发生的频率与严重程度都呈现迅猛增长趋势，发生的地点遍布全球各地，全球约有40%的淡水湖泊存在不同程度的水体富营养化[1]。中国早在20世纪50年代就已经在太湖中发现有蓝藻水华[2],到20世纪90年代即有60%以上的天然淡水湖泊有不同程度的富营养化污染现象出现[3]。天然水体富营养化已成为中国乃至世界所面临的重大环境污染问题之一[1]。

三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)属软体动物门，瓣鳃纲，真瓣鳃目，蚌科，在淡水育珠蚌中所产珍珠质量极佳，是中国特有淡水育珠双壳贝类[4]。其肉质鲜嫩，含丰富的蛋白质、无机盐和各类维生素，是常见的食物，有重要的经济价值。三角帆蚌消化系统分为口、食道、胃、肠和肛门5个部分[5]。三角帆蚌以浮游生物(主要是浮游植物)为食，其中以绿藻门最多，其次是硅藻门、裸藻门、蓝藻门的藻类[6]，三角帆蚌对微囊藻属的滤食率(14.8%)尽管一般，但消化率(63.8%)较高[7]。水华藻类对水生生物的生态毒理学作用受到国内外学者的普遍关注[8-9]。普遍认为，有毒水华藻类会导致鱼类的病理症状包括肝、肾、鳃、心脏、脑等各种器官的损害[11-12]，进而改变鱼类的活动习性，使行为异常并最终影响繁殖与存活[10]。然而在三角帆蚌中相似的研究却鲜见报道。本研究通过对比观察在不同浓度梯度的有毒铜绿微囊藻环境下的三角帆蚌消化系统的超显微结构变化，以期为三角帆蚌在水华爆发初期的饲养及其作为富营养化水体治理工具种的可行性研究提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验对象

一龄三角帆蚌2013年2月购自浙江武义三角帆蚌养殖基地，规格为壳长(100.73±8.13)mm，湿重(96.61±12.41)g。蚌取回后清洗蚌壳表面的附着物，选取150只健康蚌放入400 L的水族箱中进行暂养7 d，实验用水为曝气后的过滤自来水，每日向其投喂喜食的小球藻(Chlorellapyrenoidosa)。实验开始前48 h将蚌转移到清水中，并停止进食。实验藻类购自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库。在BG11培养基的基础上，筛选并配制最佳的培养基于光照振荡培养箱中培养。实验开始前，对藻类进行预培养，当其进入对数生长期时进行实验。

1.2 实验管理

本实验测试有毒铜绿微囊藻对三角帆蚌的影响，分为有毒铜绿微囊藻处理组(浓度为1 x 107cell/L)和对照组(仅投喂1 x 107cell/L小球藻)2个组别，且每个组设置3个重复。每个重复对应1个5000 mL的大烧杯，每个烧杯放置6只实验蚌。实验选用规格相似的36只三角帆蚌。试验周期为14 d，于实验开始(第0天)和实验结束(第14天)进行取样，每次每个重复组取一个进行实验。

1.3 组织取样

割断活体三角帆蚌闭壳肌处以打开蚌壳，从每个蚌中准确取出其肠、胃、前肠的一部分以及整个晶杆体。取下后先用8.5%的生理盐水反复冲洗，再转入2.5%的戊二醛中固定并做好标记，并于4℃下保存。

1.4 扫描电镜观察

将三角帆蚌组织样品从2.5%的戊二醛固定液中取出，转入50%、70%、90%以及100%这4个浓度梯度的酒精中逐级脱水15 min。通过导电胶将脱完水的组织样品固定到载物盘上，离子溅射镀膜法喷金，放入扫描电镜中观察其超显微组织并照相。

2 结果

2.1 有毒铜绿微囊藻对三角帆蚌晶杆体的影响

晶杆为一支细长的几丁质的棒状物，呈绿色透明状，长约5cm，最宽处直径约2 mm位于晶杆囊中。近胃腔的头颈部膨大(图1-1)而后是逐渐变细杆状的尾部(图1-2)。实验结束时，在有毒铜绿微囊藻组中的三角帆蚌晶杆囊中均未找到晶杆体，而无微囊藻组中三角帆蚌的晶杆体正常。

图1 三角帆蚌晶杆体结构

1—实验开始前的晶杆体头部(标尺 300 μm)；2—实验开始前的晶杆体尾部(标尺300 μm)。

图2 三角帆蚌前肠结构

1—实验开始前的前肠纤毛(标尺 100 μm)；2—实验开始前的前肠绒毛(标尺 20.0 μm)；3—微囊藻组的第14天前肠(标尺20.0 μm)；4—无微囊藻组的第14天前肠(标尺 20.0 μm)。

2.2 有毒铜绿微囊藻对三角帆蚌前肠的影响

前肠由黏膜层黏膜下层组成，在扫描电镜下可以观察到大量纤毛(图2-1)与绒毛(图2-2)。通过对三角帆蚌的前肠扫描电镜的观察，发现有毒铜绿微囊藻存在情况下肠道纤毛受损，造成食物泡积留、堆积(图2-3)，而无微囊藻组则无明显堆积(图2-4)。

2.3 有毒铜绿微囊藻对三角帆蚌中肠的影响

三角帆蚌的肠由黏膜层和黏膜下层组成，无肌肉层，但有少量肌纤维，黏膜层较平滑(图3-1)，可以看到大量的纤毛(图3-2)和绒毛(图3-3)。通过纤毛与绒毛的摆动，三角帆蚌得以一路畅通的输送藻类进行消化。无微囊藻组进行第14天取样时，其中肠(图3-4)与第0天相比无明显不同(图3-3)。而微囊藻组则纤毛和绒毛数量、长度明显减少并且多出圆形颗粒状食物泡(图3-5)，甚至出现被大量食物泡包裹的情况(图3-6)。

图3 三角帆蚌中肠结构

1—实验开始前的中肠(标尺 1.00 mm)；2—实验开始前的中肠纤毛(标尺 50.0 μm)；3—实验开始前的中肠绒毛(标尺 20.0 μm)；4—无微囊藻组的第14天中肠绒毛(标尺 20.0 μm)；5—微囊藻组的第14天中肠纤毛(标尺100 μm)；6—微囊藻组的第14天中肠(标尺 50.0 μm)。

2.4 有毒铜绿微囊藻对三角帆蚌胃的影响

三角帆蚌的胃呈不规则囊状，不同的部位形态结构有一定的差异。主要有黏膜层和结缔组织组成的黏膜下层两部分，肌纤维较少，粘膜层凹凸不平为起伏的沟峪状(图4-1)，主要由具有纤毛的柱状上皮细胞组成(图4-2)。在对胃部扫面电镜的观察结果中，微囊藻组(图4-3)与无微囊藻组的实验组(图4-4)的胃部无明显区别。

3 讨论

瓣鳃纲动物消化系统包括消化腺和消化道两部分。消化腺是指肝胰腺，消化道则包括口、食道、胃和肠。在藻毒素对消化腺的影响方面，国内外做了较多研究，其中Chung等人[14]研究了暴露于赤潮生物海洋卡盾藻(Chattonellamarina)下翡翠贻贝(Pernaviridis)鳃和肝胰腺的抗氧化应答，得出海洋卡盾藻并不能造成翡翠贻贝的抗氧化免疫应答；Chen等人[15]则研究了在浅水富营养化湖泊微藻肝毒素在淡水贻贝中的富集情况，得出有毒藻类对贝类的肝胰腺影响最大；相似研究得到Fernandez等人[16]的证实。

图4 三角帆蚌胃部结构

1—实验开始前的胃黏膜层(标尺 500 μm)；2—实验开始前的胃纤毛(标尺 20.0 μm)；3—微囊藻组的第14天胃(标尺20.0 μm)；4—无微囊藻组的第14天胃(标尺 20.0 μm)。

而有毒藻类对贝类消化道影响方面的研究则较少。Hegaret等人[17]研究发现双壳贝类的软体组织暴露在有毒藻类中，贝壳会产生关闭和限制滤食的行为反馈。金春华、郑忠明等人[18]研究了有毒铜绿微囊藻对三角帆蚌耗氧率和排氨率的影响，认为三角帆蚌能较好地适应低浓度的有毒藻类，但随着培养水体中有毒藻类含量的增加，其耗氧率明显增加，同时由于在高浓度微囊藻毒素影响下三角帆蚌多数时间紧闭贝壳，摄食不稳定，从而会造成代谢活动异常，导致O∶N异常。实验中发现，有毒铜绿微囊藻浓度为1×107cell/L的实验组，于实验结束时(第14天)晶杆体已经基本全部消失，这说明三角帆蚌进入高浓度铜绿微囊藻环境中，其贝壳可能产生关闭限制了滤食行为，无法滤食[13]，使其处于饥饿状态。实验后期，也确实观察到了有毒铜绿微囊藻组贝壳长期处于关闭的状态，证实了上述猜测。

Navarro等人[19]为贻贝短期喂食有毒藻发现实验组与对照组的饵料系数并无明显差距。Joana等人[20]研究实验室条件下紫贻贝对去毒藻类的吸收与净化，得出了其对去毒素有很强的适应性。实验中，对胃部扫面电镜的观察结果得出有毒铜绿微囊藻对三角帆蚌的胃部无大的不良影响，但是肠道中的纤毛与绒毛的密度与长度明显较少，以致于无法像原先一样依靠纤毛、绒毛的摆动来有效地运送食物，造成食物泡大量积留、堵塞。说明暴露于有毒铜绿微囊藻环境中，三角帆蚌将受到一定损伤。其肠道绒毛与纤毛数量的缺失与长度的缩短势必对其消化吸收效率造成影响，使其滤食同化效率降低，可能造成其生长缓慢。这与Joana等人的研究结果[20]有所不同，可能是因为他们给紫贻贝喂食的是去毒藻类，而本实验中三角帆蚌摄食的是有毒藻类。

综上所述，在水华爆发初期即水华藻类浓度并不是很高时，三角帆蚌尽管其消化系统受到影响，但并不会影响到其生存。随着水体富营养化的进一步发展，暴露于有毒水华藻类的时间延长，受损的消化系统可能导致三角帆蚌停止生长甚至死亡。本研究显示三角帆蚌作为滤食性贝类，可能通过滤食行为改善富营养化初期的水体，但是如果在有毒水华藻类中暴露的时间过长，其生存难以得到保障，其对富营养化水体长期的治理效果不太理想。

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Scanning electron microscopy observation ofHyriopsiscumingiidigestive system under toxicMicrocystisaeruginosaexposure

YUAN Ming-zhe, CHEN Shan, CHEN Jia-wei, LIU Qi-gen, HU Meng-hong

(College of Life Science and Fisheries, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

The ultrastructural changes in the digestive system such as stomach, foregut, midgut, and crystalline style of theHyriopsiscumingiicultured in different concentrations of toxicMicrocystisaeruginosawere observed during the whole experimental period. The results revealed thatH.cumingii′s crystal rod was dissolved due to starvation, when the concentration of microcystis was more than 1 × 107cell/L. ToxicM.eruginosashowed negative effects on the fluff and cilia of the intestine. The figures illustrated that fluff and cilia became fewer and less. Hereby, toxicM.eruginosamight decrease the digestive efficiency ofH.cumingii′s and have negative effects on its growth.

Hyriopsiscumingii; digestive system; toxicMicrocystisaeruginosa; scanning electron microscopy

2014-05-08；

2014-07-30

国家自然科学基金(31202015)；上海市高校知识服务平台项目(ZF1206)

胡梦红，博士，讲师，研究方向为生态养殖，E-mail: mhhu@shou.edu.cn。

S966.22+1

A

2095-1736(2015)01-0022-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.01.022