应用16SrRNA荧光定量PCR技术研究β－内酰胺类抗菌药物对婴儿肠道菌群的影响

贺 锐，张 翀，章国平，赵翠生

（甘肃省妇幼保健医院检验科，兰州 730050）

应用16SrRNA荧光定量PCR技术研究β－内酰胺类抗菌药物对婴儿肠道菌群的影响

贺 锐，张 翀，章国平，赵翠生△

（甘肃省妇幼保健医院检验科，兰州 730050）

目的探讨β－内酰胺类抗菌药物对婴儿肠道菌群的影响。方法选取0～1岁婴儿，应用16SrRNA荧光定量PCR技术，分别测定β－内酰胺类抗菌药物使用前，使用第3d、5天时，及治愈后第7天粪便中双歧杆菌、乳酸杆菌、肠球菌、大肠杆菌的水平。结果使用过β－内酰胺类抗菌药物者粪便中双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌和肠球菌的数量与未使用者比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。粪便双歧杆菌、乳酸杆菌含量随治疗时间的延长而增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。未使用抗菌药物的患儿肠道双歧杆菌和乳酸杆菌的恢复明显快于使用过抗菌药物的患儿，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论β－内酰胺类抗菌药物对婴儿肠道菌群有普遍的杀灭作用，对婴儿肠道菌群改变的影响是轻微的。β－内酰胺类抗菌药物的使用会延迟患儿肠道微生态的恢复，但若合理使用对疾病的治疗有积极作用。

肠道菌群； 抗菌药物； 16SrRNA； 婴儿

肠道菌群是人体重要的微生态系统之一，直接参与人体的消化、营养吸收、能量供应、脂肪代谢、免疫调节等多种生理功能，相当于人体的一个重要“器官”［1］。婴儿时期，肠道微生态环境初步建立，对代谢、免疫系统的发育和成熟等起着十分重要的作用［2］。β－内酰胺类抗菌药物的使用对婴儿肠道菌群的影响一直以来备受关注。本研究采用病例对照研究，运用细菌涂片、细菌培养、16SrRNA荧光定量PCR分析等检测手段，对β－内酰胺类抗菌药物的使用对婴儿肠道菌群的影响进行了初步探讨。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2011年7月至2013年3月于本院就诊的婴儿作为研究对象。健康婴儿组：4周内未使用过β－内酰胺类抗菌药物、微生态制剂且无胃肠道症状，健康体检合格的0～1岁婴儿，共50例。对照组：未使用抗菌药物，以支持治疗为主的0～1岁婴儿。研究组：合并细菌感染性疾病，以β－内酰胺类抗菌药物治疗为主的0～1岁婴儿。

1.2 方法

1.2.1 标本的采集与处理 对照组取入院第3、5天及愈后第7天粪便标本各10g，研究组留取使用抗菌药物前，使用抗菌药物第3、5天和愈后第7天的粪便标本各10g。标本置无菌杯内立即送检，进行培养、接种、涂片，剩余标本用无菌干燥管储存，－80℃冰箱保存备用。

1.2.2 肠道细菌DNA的提取 取冻存的粪便标本复融，每l g加1mL的PBS（0.05mol/L，pH7.4）充分颠倒混匀5～10 min，然后低速离心（2 000r/min）5min，取上清，上述过程重复3次，收集上清高速离心（13 000r/min）3min后取沉渣，沉淀物用PBS液洗4次，水洗1次，后加50μL蒸溜水悬浮，50μL 1%TritonX－100破碎菌体，100℃煮沸5min立即放人冰水中冷却［3］。

1.2.3 PCR引物 对所选用引物序列分别与4种细菌的16S rRNA全序列在BLAST数据库进行比较验证，4种细菌上、下游引物如下：双歧杆菌CTC CTG GAA ACG GGT GG［4］，GGT GTT CTT CCC GAT ATC TAC A，扩增片段为550bp；乳酸杆菌AGC AGT AGG GAA TCT TCC A，ATT TCA CCG CTA CAC ATG［5］，扩增片段为380bp；肠球菌TCC ACG CCG TAA ACG ATG AG，GAC ACG AGC TGA CGA CAA CC，扩增片段274bp［6］；大肠埃希菌GGA GCA AAC AGG ATT AGA TAC CC，CCC AAC ATT TCA CAA CAC G［7］，扩增片段317bp。

1.2.4 荧光定量PCR反应体系 采用25μL反应体系，包括10×Buffer 2.5μL，4×dNTP（0.25mmol/L）2μL，MgCl2（25 mmol/L）2.5μL，上下游引物（0.25μmol/L）各0.25μL，Taq酶（1U/μL）0.75μL，DNA模板3μL，荧光染料SYBR green 2.5μL，双蒸水11.25μL。应用Mx3000P型荧光定量PCR仪进行扩增与分析。

1.2.5 PCR反应条件 95℃变性5min；95℃15s，60℃1 min，72℃45s，87℃5s共40个循环；72℃延伸10min后结束。60～95℃作熔解曲线，各细菌的熔解曲线见附图1～4（见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”）

1.2.6 标准曲线制作 分别纯化上述PCR反应过程中得到的4种细菌PCR产物，具体步骤如下：在DNA溶液中加入1/10体积3mol/L pH 5.2的乙酸钠，在旋涡混合器上稍加振荡或用手指轻弹离心管壁几次使之混匀，加入2～2.5倍体积的无水乙醇，振荡混匀并置于冰上30min，离心5min弃上清，加入1mL 70%的乙醇，颠倒混匀离心弃上清，干燥沉淀。将干燥沉淀物溶于适当体积的无菌水或TE缓冲液即成。在分光光度仪上测定4种细菌纯化产物的吸光度值。参照1个吸光度值双链DNA片段（1kb）相当于4.74×1013copies/mL的标准，计算出每毫升PCR产物中所含的拷贝数，然后做10倍系列稀释，使其形成104～108copies/mL的系列浓度的溶液，按上述条件进行荧光定量PCR，形成标准曲线。

1.2.7 细菌产物的验证 通过对4种细菌标准菌株做荧光定量PCR，利用熔解曲线比较产物解链温度（TM）与标准菌株TM值的差异，经验证，肠道菌群PCR扩增产物为双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌和肠球菌的特异性产物，

1.2.8 检测灵敏度分析 通过对上述4种细菌标准菌株菌落做系列稀释（102～108cfu/mL）后行荧光定量PCR，证明100 cfu/mL细菌的检测标本仍能呈现特征性熔解曲线，说明用上述引物通过荧光定量PCR检测上述4种细菌有较好的检测灵敏度。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0软件对数据进行处理，对PCR定量检测数据进行对数处理后（log copies/g）以表示，组间两两比较采用t检验，三组及以上计量资料的比较采用方差分析，若P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

研究组粪便双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌和肠球菌水平都较对照组患儿略低，但差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。分析婴儿肠道中双歧杆菌、乳酸杆菌在使用β－内酰胺类抗菌药物治疗不同时期粪便中含量的变化，随治疗时间的延长，双歧杆菌、乳酸杆菌逐步增加，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。采用成组t检验比较研究组与对照组愈后一周肠道微生态的恢复情况，见表3，对照组患儿肠道双歧杆菌和乳酸杆菌的恢复明显快于研究组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。健康婴儿粪便双歧杆菌、乳酸杆菌的水平见表4。

3 讨 论

β－内酰胺类抗菌药物在控制婴幼儿感染性疾病中起着举足轻重的作用，由于耐药菌株的不断产生，临床β－内酰胺类抗菌药物应用日益广谱化、高档化。广谱抗菌药物大量应用导致医源性菌群失调的问题也日益凸显［8－9］，尤其是β－内酰胺类抗菌药物在婴幼儿疾病中的使用。

肠道微生态是由肠道菌群在肠道内形成的一个庞大而复杂的系统，由自身的专性厌氧菌和部分外籍菌及环境菌群构成［10］。在局部环境改变、机体免疫力下降、或广谱抗菌药物使用等条件下，正常菌群发生数量或性质的异常变化，以数量的变化为主，即肠道菌群比例失调［11］。而本研究显示，抗菌药物对肠道菌群有普遍的杀灭作用，但对合并细菌感染性疾病的婴儿肠道菌群改变的影响是有限的。感染性腹泻患儿因感染导致肠道生物屏障的破坏，抵抗细菌肠道定植的能力减弱，肠道正常的菌群结构被扰乱。合理的使用β－内酰胺类抗菌药物在治疗感染的同时可以使临床症状得到缓解，让肠道环境逐步改善。本研究显示，合并细菌感染性疾病的患儿治愈后7天肠道中益生菌的数量已经与健康婴儿已基本接近。同时，未使用β－内酰胺类抗菌药物的患儿，肠道微生态环境的恢复明显快于使用了β－内酰胺类抗菌药物的患儿，这也提示临床治疗中，应积极考虑调整患儿肠道微生态环境，以利于疾病的恢复。

婴儿疾病治疗中广谱抗菌药物β－内酰胺类抗菌药物的使用存在诸多争议，在治疗中应尽可能以病原学和药敏试验为基础，严格掌握β－内酰胺类抗菌药物的应用指标，结合婴儿肠道微生态特点，及时、合理应用微生态制剂，改善β－内酰胺类抗菌药物造成的菌群失调，增强宿主适应性，在确保抗感染疗效的同时及时纠正肠道微生态失衡对婴儿的生长发育带来的不良影响。

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The impact ofβ－lactam antibiotics on infants′intestinal flora detected by using 16S rRNA quantitative PCR technique

He Rui，Zhang Chong，Zhang Guoping，Zhao Cuisheng△
（Department of Clinical Laboratory，Maternal and Child Health Care Hospital，Lanzhou，Gansu730050，China）

ObjectiveTo investigate the influence ofβ－lactam antimicrobial drugs on infants′intestinal flora.MethodsInfants from 0to 1years old were enrolled in the study，who′s feces samples were tested for Bacillus bifidus，lactobacillus，enterococcus and E.coli by using 16SrRNA quantitative PCR technique before using antibiotics，on the third and fifth day duringβ－lactam antibiotics treatment and the seventh day after treatment.ResultsThe numbers of Bacillus bifidus，lactobacillus，E.coli and enterococci detected in usingβ－lactam antibiotics group were not statistically different from those in not using antibiotics group（P＞0.05）.The numbers of Bacillus bifidus and lactobacillus increased with the treatment process，the differencies was statistically significant（P＜0.05）.The recovery of the numbers of intestinal Bacillus bifidus and lactobacillus in not using antibiotics group was significantly faster than using antibiotics group，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusionβ－lactam antibiotics have general killing effect on the intestinal flora in infants，which could recover to normal.The recovery of intestinal flora could be delayed if antibiotics are used，however，reasonable antibiotics treatment would be very helpful in the treatment of primary diseases.

intestinal flora； antibiotics； 16SrRNA； infant

10.3969/j.issn.1673－4130.2015.03.030

A

1673－4130（2015）03－0357－03

2014－11－10）

贺锐，女，副主任检验师，主要从事微生物及分子生物学的研究。△

，E－mail：zhaocuisheng123＠126.com。