炎症性肠病与肠道菌群

闫一帆 姜 敏 孙明军

炎症性肠病（IBD）包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD），是一类病因和发病机制尚不十分清楚的肠道炎性反应性疾病。有关IBD发病机制的研究主要集中在遗传易感性、肠道免疫异常及肠道菌群改变。近年来越来越多的研究认为，IBD可能主要由遗传易感体质决定，肠道免疫调节紊乱是关键的直接发病机制，肠道菌群是这种免疫损伤过程的重要激发因素，环境、精神等因素可能是发病的诱因，这一观点得到大多数学者的支持。本文重点介绍IBD患者的肠道菌群变化及微生态制剂（MEA）在IBD中的应用。

1 肠道菌群与分布

正常生理状态下人类肠道内含近500种细菌，成人肠道菌群主要集中在结肠和末端小肠，有多达1 013种不同类型和数量的细菌，约是人体内真核细胞的10倍［1］。上段小肠中需氧菌及革兰阴性菌占绝大多数；回盲部细菌密集，厌氧菌占优势（如类杆菌、双歧杆菌、真菌、乳酸菌及梭状芽孢杆菌）；结肠中厌氧菌数量更多，优势菌为类杆菌、双歧杆菌和真菌，革兰阴性球菌、梭状芽孢杆菌、肠球菌、肠杆菌等也常见于结肠中［2］。盲肠内的细菌约25%为兼性厌氧菌，尤其是肠杆菌属。肠道的菌群大致可分为3类：（1）与宿主共生的生理性细菌，为专性厌氧菌，是肠道的优势菌群，分别是类杆菌属、双歧杆菌属、乳酸杆菌属、C.1ept u m菌属、C.coccoides菌属和肠菌属，具有营养及免疫调节作用；（2）与宿主共栖的条件致病菌，以兼性需氧菌为主，为肠道非优势菌群（肠球菌和肠杆菌），当肠道菌群紊乱或不平衡时对人体有害；（3）病原菌，大多为过路菌，长期定植的机会少，体内生态平衡时即便存在，由于数量少，不足以致病，一旦数量超出正常则致病（变形杆菌和假单胞菌）。但肠道细菌的组成目前尚未明确，只有10%～40%肠道细菌可以用培养的方法来鉴别［3］，主要原因是取样和培养比较困难。肠道菌群相互制约、相互依存，保持微生物的生态平衡，对宿主具有消化、吸收、营养和生物拮抗等生理作用，是宿主生命必需的组成部分。

2 IBD患者的肠道菌群变化

IBD的发病涉及环境、遗传易感性和免疫异常，发病的触发点可能是肠道内致病菌与正常细菌比例失调。诱发肠道炎性反应的因素有［4］：（1）肠道内致病菌增多，分泌的肠毒素使肠上皮通透性增加；（2）致病菌分泌免疫抑制性蛋白，导致黏膜免疫失调；（3）致病菌直接侵袭、损伤上皮细胞；（4）某些过度生长的细菌影响肠上皮细胞的能量代谢，导致上皮细胞损伤。

2.1 UC与肠道菌群

尽管目前UC的发病机制尚不明确，但肠道菌群与UC发病的关系是近年的研究热点，一系列临床试验和动物实验均显示，UC患者的肠道菌群与健康人群存在差异。Kleessen等［5］利用荧光原位杂交技术，发现在83%的UC患者结肠黏膜标本中存在细菌对肠黏膜的侵袭，但在对照组中并未发现。Nishikawa等［6］研究细菌16S r RNA基因的限制性片段的多态性，从UC患者标本中得到的限制性片段的数量明显少于健康对照组，说明UC患者肠道菌群多态性显著降低的主要原因是肠道共生菌减少。崔海宏等［7］采用梯度稀释方法进行肠道菌群分析，发现UC急性期患者肠道菌群中肠杆菌、肠球菌等致病菌数量明显增加，而乳杆菌等正常菌群数量明显减少，缓解期患者的拟杆菌及双岐杆菌较急性期明显增加，且与对照组间的差异无统计学意义。Ohkusa等［8］从UC患者体内分离并培养变形梭状杆菌，用含有变形梭状杆菌的上清液给小鼠灌肠，24 h后小鼠结肠细胞的变化与用丁酸溶液灌注的结果相同，均出现黏膜下溃疡、炎性细胞聚集及细胞凋亡性改变。刘伟等［9］选取广州地区40例肠道病变仅局限于乙状结肠以下的UC患者，用荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测标本中乳酸杆菌、大肠杆菌及双歧杆菌的含量，结果显示UC患者病变肠段的双歧杆菌、乳酸杆菌含量均较健康者低，大肠杆菌含量较健康者高。Macfarlane等［10］应用16S r RNA探针荧光原位杂交法研究UC患者直肠活检标本中的菌群，发现双歧杆菌数量约为正常对照组的1／30，且UC患者的双歧杆菌优势菌群与正常对照组亦有明显不同。多中心研究显示，UC患者急性期和缓解期细菌种类增加，但肠道内双歧杆菌和乳酸杆菌减少［11］。

2.2 CD与肠道菌群

Manichanh等［12］首次采用宏基因组学方法比较CD患者和健康人粪便样品中细菌的多样性组成情况，发现CD患者粪便样品中厚壁菌门的多样性明显减少。有研究在CD患者回肠分离出一种能黏附并侵入肠上皮细胞的菌株，称为adherentinvasive E.coli（AIEC），结果显示在21.7%CD患者的肠黏膜中能检测到AIEC存在，远高于对照组（6.2%），AIEC进入肠腔后感染巨噬细胞，后者释放干扰素－γ（IFN－γ）和肿瘤坏死因子－α（TNF－α），因此通过此方式能促进AIEC的定植，使炎性反应不断 加 重［13］。 有 研 究 还 发 现，另 一 种 细 菌Mycobacteriu m aviu m subsp.Paratabercalosis（MAP）能引起反刍动物发生肉芽肿性炎性反应（类似人类CD），并可使无菌饲养的白细胞介素－10（IL－10）基 因 缺 陷 小 鼠 出 现 结 肠 炎［14］。Ricanek等［15］采用r RNA分子探针技术研究CD患者回肠及结肠病变部位黏膜的细菌分布情况，结果显示，与健康对照组相比，CD患者的杆菌明显减少（42%比71%）、厚壁菌属增加（42%比28%）、变形菌增加（15%比0）。国内Liu等［16］选取了15例CD患者、23例肠道结核患者及21名健康志愿者，检测3组粪便细菌，结果显示CD患者的乳酸杆菌及双歧杆菌较健康志愿者明显减少，但拟杆菌增加。上述研究结果均表明，CD患者肠道菌群的组成与健康个体有明显的差异。

3 肠道菌群的检测方法

健康人群粪便中的微生物群数量和种类具有生理上的稳定性和恒定性。当出现胃肠道疾病时，粪便菌群在一定程度上反映肠道菌群的异常。因此，对患者粪便的细菌学检查是研究患者肠道菌群分布的重要途径。

3.1 传统肠道菌群的检测方法

传统肠道菌群的检测方法包括新鲜粪便涂片镜检和粪便细菌培养与鉴定。直接涂片粪便菌群分析方法是目前临床微生物检验中广泛采用的方法，主要用于菌群失调的快速诊断和粪便菌群状态的综合判断。该方法可综合判断粪便菌群状态，但其对菌群分布的分析是粗略的，主观因素较强，只能作为初步评价［17］。粪便中细菌组成复杂，多为厌氧菌，需要分别进行需氧和厌氧培养，在复杂的肠道菌群中，只有10%～40%可通过粪便细菌培养方法得以鉴定和定量，细菌培养周期长，操作繁琐，易受操作方法影响，灵敏度低，并且由于各种细菌的生长条件及生长率不同，使培养鉴定结果不够准确［18］。

3.2 分子生物学方法

分子生物学方法不仅能对苛养菌进行定量检测，还可以分析不同人群间肠道微生态组成的异同，常用的技术包括ERIC－PCR技术，16S r RNA基因分析、肠毒素基因筛查等。ERIC－PCR技术存在的问题是总DNA的ERIC－PCR扩增条带有随机性，在ERIC－PCR电泳指纹图谱中具有相同迁移速度的DNA片段，只能推定它们的相对分子质量相近而已，却不能肯定它们的碱基序列相同［19］。

16S r RNA是核糖体小亚基的骨架，是细菌染色体上编码16S r RNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中，全长约1 540 bp，其碱基序列含有进化速度不同的可变区和保守区，保守区在进化过程中保持稳定，可变区包括了不同菌种在进化过程中的不同突变差异，两者相互交错排列［20］。根据不同细菌的16S r RNA设计特异性引物，以待测DNA为模板进行PCR扩增，对扩增产物测序，比对基因文库，既可以进行菌种的鉴定，还可以通过实时荧光PCR定量分析检测细菌DNA的拷贝数［21］。

实时PCR对病原菌的致病基因进行定量检测，可以判断肠道中致病菌存在与否及其毒力分型。利用已知肠毒素基因的特异性引物，以待测DNA为模板进行PCR扩增，对扩增产物进行荧光检测或琼脂糖凝胶电泳，可得出标本中细菌的种类及含量。

分子生物学方法解决了苛养菌难以培养的问题，其敏感性及特异性高，省时省力，但并非十全十美，粪便中含有大量的PCR抑制物如胆红素、多种血红蛋白降解产物、植物源性多糖等，会影响PCR体系的扩增效率。

4 MEA对IBD的治疗作用

MEA包括益生菌、益生元和合生元3大类。益生菌是指活微生物，口服后影响并改变肠道微环境，最终起到有益作用，Thompson－Chagoyán等［22］将其定义为人体自有的，且对宿主自身无致病性，可定植于肠道并于肠道内繁殖，有抗菌作用，可调节免疫，并对宿主代谢活动产生影响的多种微生物。目前临床常用制剂包括双歧杆菌、乳酸杆菌、地衣芽孢杆菌等。益生元是一种不被消化的食物成分，可被正常细菌利用，能选择性地促进结肠内有益细菌的生长或活性，对宿主发挥有益的作用，主要包括菊粉、乳果糖等多种寡糖类物质。合生元是益生菌与益生元的混合物，既补充了益生菌，同时使用益生元也促进了益生菌的生长与繁殖。目前根据细菌的存活与否将微生态制剂分为活菌制剂和灭活菌制剂，临床上除乳酸菌素片和乐托儿是灭活菌制剂外，大部分是活菌制剂。

MEA的作用主要是调整和保持微生态平衡、提高宿主的健康水平，有研究表明MEA可能通过以下机制而起作用：（1）维持肠道内菌群的动态平衡；（2）增强肠黏膜免疫功能，提高免疫力；（3）生物拮抗作用；（4）增强肠道黏膜屏障；（5）抗肿瘤；（6）营养作用。

歧红阳等［23］应用含有以双歧杆菌为主的4种活菌的益生菌制剂联合美沙拉嗪治疗轻中度UC患者，其疗效优于单用美沙拉嗪。秦荣等［24］应用枯草杆菌二联活菌肠溶胶囊（美常安）联合5－氨基水杨酸（美迪莎）治疗轻中度UC患者，其缓解率明显高于单用美迪沙。Hegazy等［25］将30例UC患者随机分为两组，实验组给予柳氮磺胺吡啶（SASP，2 400 mg／d）＋益生菌，对照组仅给予柳氮磺胺吡啶（2 400 mg／d），在给药前及治疗后8周分别用紫外分光光度法检测病变部位结肠髓过氧化物酶的活性，用酶联免疫吸附法（ELISA）检测病变部位肠黏膜白细胞介素－6（IL－6）及粪钙卫蛋白的水平，用免疫组化法及RT－PCR方法检测核因子－κB（NF－κB）、p65及双歧杆菌，结果发现上述指标均较对照组明显降低。Macf arlane等［26］给活动期 UC患者口服含有双歧杆菌的合生元1个月，试验前后均用细菌学和直肠活检方法检测患者肠内细菌比例，结果发现定植在肠黏膜上的双歧杆菌明显增加，表明益生菌可改善肠道菌群。Zocco等［27］的研究中，187例静止期UC患者随机接受乳杆菌GG、美沙拉嗪或两者联合治疗，结果显示乳杆菌GG控制UC复发的作用与美沙拉嗪无明显差异，但在延长复发时间上前者更为有效。Steed等［28］对35例活动期CD患者进行一项随机双盲对照试验，给予治疗组合生元（含双歧杆菌2×1011CFU／g，2次／d），对患者进行病情评估（临床表现、肠道活检、细胞因子），结果显示治疗组的克罗恩病活动指数（CDAI）得到明显改善，而对照组则无明显改变。有研究观察非致病性酵母菌对CD的治疗作用，对32例临床缓解期患者分别用5－氨基水杨酸或5－氨基水杨酸联合酵母菌治疗6个月，结果显示单独用5－氨基水杨酸组的CD复发率为37.5%，而与MEA合用的患者CD复发率仅为6.25%［29］。

5 存在的问题和展望

综上所述，IBD患者的肠道菌群与健康人存在差异，究竟是哪些菌群导致了IBD？是IBD导致肠道菌群变化，还是肠道菌群变化诱导IBD？这些问题均有待进一步研究。肠道菌群与IBD的发病密切相关，益生菌治疗IBD的疗效是肯定的，但是存在一些问题，目前缺少对MEA治疗IBD的大样本随机双盲对照临床试验，MEA治疗IBD的时机、剂量、疗程、安全性问题尚不明确。通过深入研究，相信未来益生菌将被广泛应用于临床治疗IBD。

1 Hawrelak JA，Myers SP.The causes of intestinal dysbiosis：a review.Altern Med Rev，2004，9：180－197.

2 Kanauchi O，Mitsuyama K，Araki Y，et al.Modification of intestinal flora in t he treat ment of infla mmat or y bo wel disease.Curr Phart Des，2003，9：333－346.

3 Zhang J，Han Y，Wang JH.Advance on t he relationship bet ween infla mmat or y bowel disease and intestined bacteria.World Chin J Digestol，2007，15：1406－1410.

4 Shin DQ，Targan SR.Insights into IBD pat hogenesis.Curr Gastr oenterol Rep，2009，11：473－480.

5 Kleessen B，Kroesen AJ，Buhr HJ，et al.Mucosal and invading bacteria in patients wit h infla mmat or y bowel disease co mpared with controls.Scand J Gastroenterol，2002，37：1034－1041.

6 Nishikawa J，Kudo T，Sakata S，et al.Diversity of mucosaassociated micr osiota in active and inactive ulcerative colitis.Scand J Gastroenterol，2009，44：180－186.

7 崔海宏，陈村龙，孙勇，等.炎症性肠病患者肠黏膜菌群改变及抗体反应.胃肠病学和肝病学杂志，2003，12：276－278.

8 Ohkusa I，Ohkusa T，Ogihara T，et al.Induction of experi mental ulcerative colitis by Fusobacteriu m variu m isolated fro m colonic mucosa of patients with ulcerative colitis.Gut，2003，52：79－83.

9 刘伟，刘翔，林漫鹏，等.溃疡性结肠炎患者正常与病变肠段肠道菌群比较.湖北民族学院学报：医学版，2011，28：4－6.

10 Macfarlane S，Furrie E，Cu mmings JH，et al.Chemotaxono mic analysis of bacterial populations colozining the rectal mucosa in pations wit h ulcerative colitis.Clin Infect Dis，2004，38：1690－1699.

11 Fyderek K，Str us M，Ko walska－Duplaga K，et al.Mucosal bacterial micr oflora and mucus layer t hickness in adolescents wit h infla mmator y bowel disease.World J Gastr oenterol，2009，15：5287－5294.

12 Manichanh C，Rigottier－Gois L，Bo mmaud E，et al.Reduced diversity of faccal microbiota in Cr ohn′s disease revealed by a metagenomic approach.Gut，2006，55：205－211.

13 Bar nic N，Carvalho FA，Glasser AL，et al.CEACA M6 acts as a receptor f or adherent－invasive E.coli，supporting ideal mucosa colonization in Cr ohn disease.J Clin Invest，2007，117：1566－1574.

14 Singh UP，Sigh S，Singh R，et al.Influence of Mycobacteriu m aviu m subsp.paratabercalosis on colitis develop ment and specific i mmune responses during disease.Infect Immun，2007，75：3722－3728.

15 Ricanek P，Lot he SM，Fr ye SA，et al.Gut bacterial pr ofile in patients newly diagnosed wit h treat ment－naïve Cr ohn′s disease.Clin Exp Gastroenter ol，2012，5：173－186.

16 Liu X，Cui Y，Ouyang C，et al.Characteristics and differential diagnosis of intestinal flora in Crohn′s disease and intestinal tuberculosis.Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2010，35：1196－1200.

17 张秀荣.肠道菌群粪便涂片检查图谱.北京：人民军医出版社，2000.

18 杨美芬，王玉明，黄永坤，等.细菌16S r RNA荧光定量PCR法检测肠道菌群的变化.中国微生态学杂志，2006，18：266－269.

19 张静，韩英，王继恒，等.UC和其他肠道疾病肠道菌丛结构的ERIC－PCR指纹图谱分析.胃肠病学和肝病学杂志，2007，16，430－433.

20 白鹏，吕愈敏，顾芳.细菌16S DNA荧光定量PCR法分析溃疡性结肠炎患者肠道菌群变化.胃肠病学和肝病学杂志，2008，17：566－571.

21 Matsuki T，Watanabe K，Fuji moto J，et al.Quantitative PCR with 16S r RNA－gene－taigeted species－specific pri mers for analysis of hu man intestinal bifidobacteria.Appl Envir on Microbiol，2004，70：167－173.

22 Tho mpson－Chagoyán OC，Maldonado J，Gil A.Aetiology of infla mmatory bowel disease（IBD）：role of intestinal micr obiota and gut－associated ly mphoid tissue i mmune response.Clin Nutr，2005，24：339－352.

23 歧红阳，王云溪，肖占宇.美沙拉嗪联合双歧杆菌四联活菌治疗溃疡性结肠炎的临床效果评价.职业与健康，2011，27：1431－1432.

24 秦荣，朱淑军，王光恺.枯草杆菌二联活菌肠溶胶囊联用5－氨基水杨治疗溃疡性结肠炎64例.广东医学，2010，31：1739－1740.

25 Hegazy SK，El－Bedewy M M.Effect of probiotics on proinfla mmatory cytokines and NF－kappa B activation in ulcerative colitis.World J Gastroenterol，2010，16：4145－4151.

26 Macfarlane S，Furrie E，Kennedy A，et al.Mucosal bacteria in ulcerati colitis.Br J Nutr，2005，93（Suppl 1）：S67－S72.

27 Zocco MA，dal Ver me LZ，Cremonini F，et al.Efficacy of Lactobacillus GG in maintaining re mission of ulcerative colitis.Ali ment Phar macol Ther，2006，23：1567－1574.

28 Steed H，Macfarlane GT，Blackett KL，et al.Clinical trial：t he microbiological and i mmunological effects of sy mbiotic consu mption－－a rando mized double－blind placebo－contr olled study in active Crohn′s disease.Ali ment Phar macol Ther，2010，32：872－883.

29 Guslandi M，Mezzi G，Sorghi M，et al.Sacchar o myces boular dii in maintenance treat ment of Crohn′s disease.Dig Dis Sci，2000，45：1462－1464.