黑皮鸡枞菌丝体液体发酵条件优化

徐兵，张雅君，冀宏

（常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏 常熟 215500）

黑皮鸡枞菌丝体液体发酵条件优化

徐兵，张雅君，冀宏

（常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏 常熟 215500）

以黑皮鸡枞菌深层液体发酵菌丝体生物量为指标，首先通过单因素试验确定了最佳的培养温度、摇床转速、pH值、发酵周期，然后经过响应面试验的优化，得出最佳发酵条件：培养温度为26℃，摇床转速为175 r/min，pH值为7.6，发酵周期为25 d.通过验证培养后，黑皮鸡枞菌丝体干重达6.91 mg/mL.

黑皮鸡枞；深层发酵；优化

黑皮鸡枞菌（termitomyces albuminosus）是属担子亚门菌，层菌纲，伞菌目，口蘑科［1-4］.其肉质鲜嫩，口感独特，作为食品药品皆可，备受人们青睐.黑皮鸡枞菌是科研人员历经数年研究［5］，于2006年选育出能人工栽培的珍稀食用菌，胡尚勤［6］、曾先福［7］等对鸡枞菌的生长条件有研究，罗晓妙［8］对于鸡枞菌菌丝体的液体培养进行了条件优化，薛林浩［1］等对鸡枞菌液体培养基进行了优化实验，但目前对于黑皮鸡枞菌丝体液体发酵条件的优化尚未见报道.本文针对黑皮鸡枞菌株深层发酵条件优化展开研究，旨在为实现黑皮鸡枞菌扩大化生产提供数据.

1 材料与方法

1.1 实验原料和设备

黑皮鸡枞：常熟理工学院食用菌发酵工程技术研究中心种植.

实验设备：电热恒温干燥培养箱303A-3S型：浦东荣丰科学仪器厂；电热鼓风干燥箱GZX-GF101-AO-S型：南京百思威科技有限公司；立式压力蒸汽灭菌器LDZX-75KBS（内循环）型：南京菲奇工贸有限公司；电子天平M124A型：南京菲奇工贸有限公司；洁净工作台SW-CJ-2F型：苏州净化公司；震荡培养箱ZQWY-200G型：上海知楚仪器有限公司.

1.2 实验方法

1.2.1 培养基配方

斜面培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，水1000 ml，琼脂20 g，pH自然.

种子培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，水1000 ml，VB10.002 g，pH自然.

发酵培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，水1000 ml，VB10.002 g，VB60.006 g，将发酵培养基配好后，用0.5 mol/L的NaOH和HCL调节pH至指定pH值.

1.2.2 液体培养

先对黑皮鸡枞进行组织分离，做成母种，再将母钟接种到种子培养基，在震荡培养箱中静置48 h后，震荡培养，25 d后按10%的比例接种于发酵培养基，在震荡培养箱中静置48 h后，按实验方案进行震荡培养，得到的菌丝体用60目删网过滤，用电热鼓风干燥箱于60℃烘干至恒重，计算菌丝体干重.

1.2.3 单因素试验

（1）温度的影响.以菌丝体干重作为指标，在摇床转速160 r/min，培养时间为30 d，pH值为7的条件下，将温度分别设为21，24，27，30，33℃5个不同的梯度，考察不同温度对黑皮鸡枞发酵产菌丝体的影响.

（2）摇床转速的影响.以菌丝体干重作为指标，在温度为27℃，培养时间为30 d，pH值为7的条件下，将摇床转速分别设为120，140，160，180，200 r/min 5个不同的梯度，考察不同摇床转速对黑皮鸡枞发酵产菌丝体的影响.

（3）发酵周期的影响.以菌丝体干重作为指标，在培养温度为27℃，摇床转速为160 r/min，pH值为7的条件下，将发酵周期分别设定为15，20，25，30，35 d 5个不同的梯度，考察不同发酵周期对黑皮鸡枞发酵产菌丝体的影响.

（4）PH值的影响.以菌丝体干重作为指标，在温度27℃，摇床转速为160 r/min，培养时间30 d的条件下，将pH值调至5，6，7，8，9 5个不同的梯度，考察不同初始pH值对黑皮鸡枞发酵产菌丝体的影响. 1.2.4响应面试验设计

对影响黑皮鸡枞液体发酵的关键因素（温度、摇床转速、发酵周期、PH值）进行响应面优化，采用Box-Behnken模型进行设计，采用Design Expert 8.05 b软件进行数据处理.

2 结果与分析

2.1 发酵条件优化单因素试验

2.1.1 温度的影响

由图1可知，黑皮鸡枞菌丝体干重刚开始随着温度上升，菌丝体干重也相应提高，但当发酵温度达到27℃后，黑皮鸡枞菌丝体干重逐渐下降，因此，选择27℃作为最佳的发酵温度，当前菌丝体干重为5.42 mg/mL.

图1 温度对黑皮鸡枞菌丝体的影响

图2 摇床转速对黑皮鸡枞菌丝体的影响

表1 编码与因子实际浓度的对应关系

2.2.2 摇床转速的影响

由图2可知，黑皮鸡枞菌丝体干重刚开始随着摇床转速上升，菌丝体干重也相应提高，但当摇床转速达到160 r/min后，黑皮鸡枞菌丝体干重逐渐下降，因此，选择160 r/min为最佳的摇床转速.

2.2.3 发酵周期的影响

由图3可知，从发酵开始到第25天，菌丝生长进入了对数生长期，发酵第25天，菌丝体产量最大，之后菌丝体产量开始下降，因此选择25 d作为最佳的发酵周期.

2.2.4 pH值的影响

由图4可知，当pH值为7时，黑皮鸡枞菌丝体干重最大.当pH值高于7时，菌丝体产量下降，因此，选择7作为最佳pH值.

2.3 响应面试验设计

按照Design Expert 8.05 b软件中的Box-Behnken Design方法，经拟合后得到的回归方程为：菌丝体干重=5.84+0.059 A+1.5 B-0.40 C－0.37 D+0.065 AB+0.48 AC－1.24 AD－0.13 BC+0.6 BD－0.028 CD－0.91 A2－1.12 B2+0.04 C2－1.14 D2

对该回归方程进行方差分析，结果见表3.结果表明，该模型极显著（P=0.0001< 0.01）.R2=0.9537，说明模型与试验拟合较好，可用于设计范围内的预测.

图3 发酵周期对黑皮鸡枞菌丝体的影响

表2 Box-Behnken试验设计及结果

由表3可知，在一次项中，摇床转速对黑皮鸡枞菌丝体干重的影响极显著（P＜0.0001），发酵周期对黑皮鸡枞菌丝体干重的影响显著（P=0.0071），pH值对黑皮鸡枞菌丝体干重的影响显著（P=0.0111），而温度对菌丝体干重的影响为不显著.在二次项中，温度、摇床转速和发酵周期的影响都达到了极显著水平.交互项中，温度和pH值的交互作用极显著，其他各因素的交互作用都不显著.

接表2

表3 响应面试验方差分析

根据Design Expert 8.05 b软件对数据进行二次多元回归拟合，所得到的二次回归方程的响应面图和等高线图如图8～图10所示，以此确定出各个因素的最佳水平.

图5 温度及摇床转速对黑皮鸡枞菌丝体干重交互作用的响应面图

图6 温度及摇床转速对黑皮鸡枞菌丝体干重交互作用的等高线图

图7 pH值及摇床转速对黑皮鸡枞菌丝体干重交互作用的响应面图

图8 pH值及摇床转速对黑皮鸡枞菌丝体干重交互作用的等高线图

图9 pH值及温度对黑皮鸡枞菌丝体干重交互作用的响应面图

图10 pH值及温度对黑皮鸡枞菌丝体干重交互作用的等高线图

通过分析预测得到黑皮鸡枞菌丝体干重最大值为6.96 mg/mL，即当A（温度）=25.62℃，B（摇床转速）= 175.73 r/min，C（发酵周期）=25.00 d，D（pH）=7.62.考虑到实际操作方便，最终确定发酵条件的组合为：温度26℃，摇床转速175 r/min，发酵周期25 d，pH 7.6.用以上得到的最优配方重复试验3次，3次试验菌丝体干重平均值为6.91 mg/mL，与预测值差别不大，由此可以看出，预测出的回归方程为黑皮鸡枞菌丝体液体发酵提供了一个合适的模型.优化后黑皮鸡枞菌丝体产量提高，为进一步的放大实验提供了理论参考.

3 结论

由单因素试验可知，试验菌株液体发酵最佳温度为26℃，摇床转速为160 r/min，发酵周期为25 d，pH值为7.响应面试验优化后的最佳发酵条件为温度26℃，摇床转速175 r/min，发酵周期25 d，pH值为7.6.在此条件下发酵后，黑皮鸡枞菌丝体干重达6.91 mg/mL，比优化前提高了35%.本试验首次对黑皮鸡枞菌丝体深层液态发酵工艺进行了研究，为黑皮鸡枞菌的进一步扩大化生产提供了参考.

［1］薛林浩，王晓东，蔡虹，等.黑皮鸡枞菌液体培养基优化［J］.内江师范学院学报，2013，28（10）：24-27.

［2］邹盛勤，陈武.食用菌的营养成分·药理作用及开发利用［J］.安徽农业科学，2005，33（3）：502-503.

［3］卯晓岚.中国大型真菌［M］.郑州：河南科学技术出版社，2000：142-143.

［4］付子艳，李荣春.鸡枞菌属关系的初步研究［J］.福建农林大学学报（自然科学版），2009，38（3）：271-274.

［5］孙思国.一种黑皮鸡枞菌生产方法：200710115866［P］.2007-12-26.

［6］胡尚勤，刘天贵，李贤柏.鸡枞菌的培养条件研究［J］.食品与生物技术学报，2008，27（1）：67-70.

［7］曾先富，陈阳婷，熊维全，等.鸡枞菌菌丝体培养试验［J］.食用菌，2012，34（6）：9-10，18.

［8］罗晓妙.液态发酵产鸡枞菌菌丝体的条件优化［J］.食品科技，2010，35（3）：29-33.

Predominant Strains Breeding and Optimization of Submerged Liquid Fermentation Conditions of Termitomyces Albuminosus

XU Bing,ZHANG Yajun,JI Hong
(School of Biology and Food Engineering,Changshu Institute of Technology,Changshu 215500,China)

Termitomyces albuminosus was studied in this paper.Its mycelium biomass was taken as indexes through submerged liquid fermentation.First,the best culture temperature,shaking speed,pH and fermentation period were identified through the single factor experiment.Then,the optimum fermentation conditions were obtained through the response surface experiments:the optimum temperature was 26℃,the shaker speed was 175 r/min and pH was 7.6,the fermentation period was 25 days.Under the above conditions,the dry weight of agaric mycelium reached 6.91 mg/mL.

Termitomyces albuminosus;submerged fermentation;optimization

Q949.32

A

1008-2794（2017）02-0104-05

2016-05-17

常熟理工学院青年基金项目“黑皮鸡枞液体菌种的制备及发酵条件的优化”（QZ1504），常熟理工学院重点毕业论文“黑皮鸡枞菌丝体液体发酵条件优化”（1655LG）

冀宏，教授，博士，研究方向：食、药用菌工程技术研究及现代农业技术经济与管理，E-mail：jihong@cslg.cn.