甜荞重组自交系（RIL）亲本基因组RAPD标记的多样性分析

郭菊卉+田娟+石桃雄+陈庆富

摘要：以贵州师范大学荞麦产业技术研究中心建立的两个甜荞（Fagopyrum esculentum）重组自交系群体（Homo×甜自100和Lorena-3×甜自21-1）的亲本为研究对象，选取了5个多态性好、带型清楚的随机引物进行RAPD分析，计算了每对亲本之间的相似度系数，并构建了各亲本的RAPD指纹图谱。结果表明，在Homo×甜自100和Lorena-3×甜自21-1的亲本中，平均相似度系数分别为39.13%和42.69%;在构建的RAPD指纹图谱中，有29条谱带为Homo（P1）所独有，27条谱带为甜自100（P2）所特有;有26条谱带为Lorena-3（P1）所独有，25条谱带为甜自21-1（P2）所特有。荞麦特异谱带可以作为品种鉴定的分子标记。

关键词：甜荞（Fagopyrum esculentum）;RAPD;多样性;DNA指纹图谱

中图分类号：S517            文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2015）02-0284-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.008

The Diversity Analysis of Parents of Common Buckwheat RIL Populations

with RAPD Markers

GUO Ju-hui，TIAN Juan，SHI Tao-xiong，CHEN Qing-fu

（Research Center of Buckwheat Industry Technology/Institute of Plant Genetics and Breeding， School of Life Science，

Guizhou Normal University， Guiyang 550001， China）

Abstract： The genomic polymorphisms of four parents of two common buckwheat RIL populations were analyzed with RAPD markers of 5 random primers. The results showed that there were the average index of similarity of 39.13% and 42.69% in the parents of the crosses Homo×Tianzi 100 and Lorena-3×Tianzi 21-1， respectively. There were 29 unique bands for Homo（P1） and 27 for Tianzi 100 in the first cross，and 26 for Lorena-3 and 25 for Tianzi 21-1 in the second cross.

Key words：common buckwheat; RAPD; diversity; DNA fingerprint

甜荞（Fagopyrum esculentum）为荞麦大粒组类群7个生物学物种之一[1]。Chen[2，3]的试验研究表明，普通荞麦中存在着大量的形态变异，而对这些变异进行深入研究将在很大程度上有利于遗传育种。基因控制着生物体的性状表达和变异，研究DNA分子的多态性也会促进对形态变异的进一步探索，并在遗传育种中为选择强优势组合的亲本进行杂交和荞麦资源的鉴定提供科学依据[4]。

RAPD技术是以PCR为基础的一项检测物种DNA多态性的分子技术[5]。该技术的优点是DNA样品需求量小;无种属和基因组结构特异性，一套引物可用于不同生物基因组分析;试验成本低;试验技术简单，检测速度较快。RAPD在荞麦中应用主要集中在荞麦的遗传多样性和种间系统关系研究方面[6]。通过建立RAPD指纹图谱，寻找每个种类的恒定谱带和独特谱带，可以迅速准确地对荞麦种类进行鉴别。近年来，RAPD技术已应用于多种植物杂交组合后代鉴定[7，8]和种子纯度的检测等。Ohinshi等[9]、Tsuji等[10]利用AFLP和RAPD技术研究苦荞栽培品系和天然种群间的系统发育关系。Sharma[11]应用RAPD技术研究了荞麦属14个种之间的遗传多样性。Kump等[12，13]采用RAPD技术进行了苦荞33个栽培种之间遗传关系的分析。许瑾等[4]利用RAPD技术对荞麦属的9个品种进行基因组指纹图谱分析。谭萍等[14]采用RAPD方法对国内10个荞麦栽培种进行基因型分析，并建立了指纹图谱。Pan等[15]以F. esculentum Moench， F. esculentum var. homotropicum 及其杂交所建立的 225 株 F2代分离群体为材料，进行了 RAPD 与 STS 标记分析和重要形态性状遗传分析，并由此构建遗传标记连锁图谱，共涉及87个RAPD标记，12个STS标记。覆盖基因组长度655.2 cM。总的说来，由于普通荞麦自交不亲和，相关研究主要以荞麦品种或品系为材料，主要运用RAPD等标记。

在重组自交系中，利用亲本DNA样品进行RAPD 标记引物筛选，并将重复性好的引物进行其可育F2代分离群体样本的PCR扩增，用以分析甜荞RAPD标记多态性和构建起分子遗传连锁图谱。本研究对普通荞麦重组自交系群体亲本组合（Homo×甜自100，Lorena-3×甜自21-1）的亲本用5种随机引物的RAPD谱带进行多态性分析和指纹图谱建立，以期为其F2代自交系群体的进一步研究打下基础。endprint

1  材料与方法

1.1  试验材料

本研究选用了甜荞重组自交系的4个亲本甜荞种，分别为Lorena-3、甜自21-1、甜自100和Homo。重组自交系的亲本组合为：Homo×甜自100，Lorena-3×甜自21-1。甜荞品种由贵州师范大学荞麦产业技术研究中心提供。

1.2  DNA提取

取2～3周苗龄的新鲜健康叶片约300 mg置于研钵中，倒入液氮，研成粉末。将该粉末直接转入装有预热的含有15 μL β-巯基乙醇的1 000 μL 2% CTAB提取缓冲液（质量浓度2% CTAB，100 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl，50 mmol/L EDTA-Na2，1.4 mol/L NaCl，质量浓度2% PVP）的5 mL离心管中，轻轻摇动使其充分混匀，置于65 ℃水浴中保温60 min（每隔20 min轻轻颠倒混匀1次），加入酚/氯仿/异戊醇混合液（25∶24∶1，V/V/V），充分混匀，常温下静置10 min，10 000 r/min 离心10 min。将上清液加入氯仿/异戊醇混合液（24∶1，V/V），轻轻混匀，室温下10 000 r/min离心10 min。将上清液转移到干净的离心管中，加入2倍体积-20 ℃冰冻的无水乙醇，轻轻颠倒离心管直至出现白色絮状沉淀，将离心管放在    -20 ℃中沉淀10 min。离心沉淀DNA并将沉淀用 -20 ℃冰冻的体积分数为70%的乙醇洗涤两次，在室温下使DNA沉淀干燥。加入600 μL TE缓冲液，完全溶解后，置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.3  引物

共使用了5个随机引物，各引物序列见表1。该引物从贵州师范大学荞麦产业技术研究中心设计的25个引物中选取，以亲本间多态性好、电泳带型清晰、重复性好为主要筛选原则。

1.4  PCR反应体系

试验中，RAPD检测使用的PCR反应体系见表2。PCR反应程序为：94 ℃预变性10 min;94 ℃变性1 min，Tm（引物不同温度不同）退火1 min，72 ℃延伸2 min，38个循环;72 ℃延伸10 min。

1.5  统计分析方法

扩增产物于0.8%的琼脂糖凝胶中电泳，在BioSenSC805型全自动凝胶成像系统的Analysis工具栏中，点击消除背景图标以消除图像本底的干扰;点击自动检测所有泳道的条带图标以进行各泳道内条带检测;点击相对分子质量计算图标，以Marker泳道内的Marker条带的相对分子质量为标准设定相对分子量曲线图，关闭Marker窗口，则会显示各个条带的相对分子质量，统计各泳道内的条带数。

参考文献[16]，采用条带相似度系数分析条带的多样性。相似度系数SD=（2nAB）/（nA+nB），nA为A泳道内的DNA条带数，nB为B泳道内的DNA条带数，nAB是A、B泳道内共有的条带数。

2  结果与分析

2.1  亲本甜荞的RAPD电泳图谱

不同引物扩增的亲本甜荞的RAPD电泳图谱如图1和图2所示。

2.2  亲本甜荞RAPD标记的多样性分析

根据筛选出的5个随机引物的RAPD扩增结果，可以对每对杂交组合中的两个亲本进行扩增条带的多样性分析，两对杂交组合亲本中各引物的扩增情况与相似度系数见表3和表4。

由表3可知，对亲本Homo（P1）×甜自100（P2）的组合进行RAPD扩增，5个引物共扩增出92条谱带，平均每个随机引物产生了18.4条谱带。这些引物的扩增产物为17～20条谱带，其中扩增条带数目最多的是引物R1182，共有20条谱带;其次为引物R52和R428，均为19条谱带;最少的为引物R41和R353，扩增出17条谱带。

对亲本Homo（P1）×甜自100（P2）组合的所有随机引物的RAPD标记多样性进行检测，结果（表3）表明，在5个随机引物获得的92条谱带中，有18条谱带在两亲本间表现为相同谱带，RAPD标记的相似度系数为39.13%（36/92）。对于每一条引物的相似度系数来说，其变化范围为31.58%（6/19）～50.00%（10/20）。其中RAPD标记的相似度系数最高的引物是R1182，达到了50.00%，引物R428的标记相似度系数最低，为31.58%（6/19）。因此，本研究所采用的杂交组合亲本Homo（P1）×甜自100（P2）在基因组DNA水平上存在较低的RAPD标记相似度系数，即DNA水平上条带的多样性较为丰富。有利于其子代群体获得更为广泛的性状变异。

由表4可知，对亲本Lorena-3（P1）×甜自21-1（P2）的组合进行RAPD扩增，5个引物共扩增出89条谱带，平均每个随机引物产生了17.8条谱带。这些引物的扩增产物为15～20条谱带，其中扩增条带数目最多的是引物R1182，共有20条谱带;而后依次为R52、R353、R41、R428，扩增出的谱带数分别为19、18、17、15。

对Lorena-3（P1）×甜自21-1（P2）的亲本组合所有随机引物的RAPD标记多样性进行检测，结果（表4）表明，在5个随机引物获得的89条谱带中，有51条谱带在两亲本间的表现存在差异性，RAPD标记的相似度系数为42.69%（38/89）。对每条引物的标记相似度系数来说，其变化范围为40.0%（6/15）～47.06%（8/17）。其中RAPD标记的相似度系数最低的引物为R428和R1182，相似度系数为40.00%，R41的标记相似度系数最高，达47.06%（8/17）。因此，本研究所采用的杂交组合亲本Lorena-3（P1）×甜自21-1（P2）基因组DNA水平上同样存在较低的RAPD标记相似度，也存在较高的多样性，将有利于其子代群体获得更为广泛的性状变异。endprint

2.3  亲本甜荞的RAPD指纹图谱

根据全部随机引物扩增产物的数据统计分析结果，将能在亲本组合中稳定扩增出现的、且具有差异的特异性谱带用来构建亲本组内P1和P2的RAPD标记指纹图谱。在Homo（P1）×甜自100（P2）的亲本中，共扩增出56条差异性谱带（表5）;在Lorena-3（P1）×甜自21-1（P2）的亲本中，共扩增出51条差异性谱带（表6）。

由表5和表6可知，Homo（P1）×甜自100（P2）和Lorena-3（P1）×甜自21-1（P2）组合亲本RAPD指纹图谱存在较明显的差异性。前者中有28条谱带为Homo（P1）所独有，27条谱带为甜自100（P2）所特有;后者中有24条谱带为Lorena-3（P1）所独有，24条谱带为甜自21-1（P2）所特有。因此，在每对杂交组合中，存在差异的谱带可看作是两亲本的特征性谱带，而由RAPD指纹图谱所反应的这些特征谱带可以作为鉴别亲本的依据，也可为进一步对杂交组合中亲本的DNA多态性及其他分子遗传研究打下基础。

3  讨论

Deng等[17]利用7个随机引物对19个荞麦（包括甜荞和苦荞）品种进行RAPD分析，结果表明其平均多态性达94.89%，而本研究结果表明，甜荞重组自交系的两对亲本组合的平均相似度系数分别为39.13%（Homo×甜自100）和42.69%（Lorena-3×甜自21-1），再次在DNA水平上说明荞麦种间的多态性远高于种内多态性。同时，对同属甜荞品种的两个亲本组合而言，其低于50%的相似度系数也从DNA的角度解释了甜荞异花授粉、自交不亲和等生殖学特征所带来的物种基因重组的多态性现象。在对荞麦进行种类划分的研究中，部分种类难以从形态学上进行识别，分类特征也常存在较大变异，难以把握。本研究在DNA水平上进行的RAPD遗传标记分析可对荞麦品种鉴别和遗传歧化研究提供依据。

此外，本研究以重组自交系亲本为研究对象进行RAPD分析，发现自交系群体亲本之间存在较多的特异RAPD谱带，也可为以重组自交系为研究对象进行的相关农艺学特征遗传及分子标记研究奠定基础。

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