高迁移率族蛋白1在小鼠动脉粥样硬化斑块中的分布及表达

肖湖南，刘宏斌，侯聪聪，于 茜

解放军总医院 南楼心血管内科，北京 100853

高迁移率族蛋白1在小鼠动脉粥样硬化斑块中的分布及表达

肖湖南，刘宏斌，侯聪聪，于 茜

解放军总医院 南楼心血管内科，北京 100853

目的研究高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)在正常小鼠及高脂喂养的ApoE-/-小鼠主动脉及动脉粥样硬化斑块中分布及其在动脉粥样硬化不同时期的表达。方法8周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠12只以及C57BL/6 ApoE-/-雄性小鼠12只分别作为对照组及实验组，每组分为两个亚组，早中期组(10周高脂饮食)及晚期组(20周高脂饮食)。10周、20周时处死小鼠，主动脉窦冷冻切片用于油红O染色评估斑块大小，巨噬细胞免疫组化染色用于定位巨噬细胞；主动脉窦石蜡切片用于HMGB1免疫组化染色检测HMGB1表达。结果HMGB1在正常小鼠主动脉中主要表达于内皮细胞胞核，在ApoE-/-小鼠主动脉动脉粥样硬化斑块中主要表达于内皮细胞、巨噬细胞胞核及细胞质，平滑肌细胞胞核亦有少量表达；早中期动脉粥样硬化HMGB1的表达高于晚期动脉粥样硬化HMBG1的表达(0.05±0.067 vs 0.02±0.053)；晚期动脉粥样硬化斑块面积比高于早中期动脉粥样硬化斑块面积比(0.40±0.03 vs 0.25±0.02)；巨噬细胞分布于内膜下，是斑块的主要成分。结论HMGB1在动脉粥样硬化斑块中主要表达于内皮细胞、巨噬细胞；早中期HMGB1的表达高于晚期。

高迁移率族蛋白1；动脉粥样硬化；炎症

近些年，在脓毒症等危重医学研究领域发现高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)作为晚期炎性因子参与炎症反应，中和HMGB1可明显抑制炎症反应及动物模型的死亡率[1]。多种炎性因子(TNF-α、IL-1等)能作用于炎症细胞，刺激其释放HMGB1[2]。目前认为，HMGB1在炎症进展过程中，存在着炎症瀑布反应，对多种疾病如脓毒症、自身免疫性疾病、肿瘤等均有促进疾病发展的作用[3]。HMGB1有两个主要功能：一是作为核蛋白，稳定核小体及DNA，促进转录；二是由坏死细胞释放或者炎症细胞(如巨噬细胞、NK细胞)分泌，具有触发炎症的功能[1,3]。细胞外的HMGB1主要通过与细胞的RAGE、TLR4、TLR2等受体作用激活炎症通路，可以促进巨噬细胞、树突状细胞等炎症细胞分泌炎性因子(TNF-α、IL-β、IL-6等)[3-5]。HMGB1对血管细胞的影响主要是刺激平滑肌细胞的迁移和增殖、活化内皮细胞、诱导巨噬细胞的侵入以及促进树突状细胞的成熟[6]。在动脉粥样硬化斑块进展中，HMGB1与斑块中的炎症反应密切相关[7-8]。研究HMGB1在小鼠主动脉及动脉粥样硬化斑块中的分布及其在不同时期的表达能够更加明确HMGB1在斑块进展中的作用。本研究通过对正常小鼠及动脉粥样硬化模型小鼠主动脉进行免疫组化分析，研究HMGB1在小鼠主动脉及动脉粥样硬化斑块中分布。

材料和方法

1 材料与试剂 兔抗小鼠HMGB1抗体(Boster Bioengineering Company Limited，Wuhan，China)；兔免疫组化检测试剂盒(CWBIO，China)；大鼠抗小鼠巨噬细胞抗体MOMA-2(Bio-Rad AbD Serotec，Oxford，UK)；大鼠免疫组化检测试剂盒(Beijing Zhong Shan Golden Bridge Biotechnology Co.，Ltd.，Beijing，China)；DAB显色试剂盒(TIANGEN BIOTECH，BEIJING，CO，LTD)；改良油红O染色试剂盒(Beijing Leagene Biotech.CO，Ltd)。

2 实验动物及分组 8周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠12只，C57BL/6 ApoE-/-雄性小鼠12只，C57BL/6小鼠平均体质量为(25±2) g，ApoE-/-小鼠平均体质量为(25±1) g，均购自南京君科生物科技有限公司(BetterBiotechnology Co，Ltd.)。对照组为正常饮食的C57BL/6小鼠；实验组为高脂喂养的ApoE-/-小鼠，分为两个亚组，早中期组(10周高脂饮食)及晚期组(20周高脂饮食)。饲养于IVC环境，高脂饮食(21%猪油脂肪，0.15%胆固醇，南京君科生物科技有限公司)，12 h光照周期。自由饮水，室温为(23±2)℃，湿度50%±5%。

3 油红O染色检测斑块大小 分别于10周高脂饮食、20周高脂饮食后，用致死剂量的戊巴比妥钠处死小鼠，胸腹联合解剖，心脏直视下取血；左心室PBS缓冲液冲洗循环系统，主动脉根部剪断主动脉，为了分析斑块大小，主动脉窦连续冷冻切片(6μm thick)从主动脉瓣出现开始收集，每隔10张切片取1张，每只小鼠取5张。切片用改良油红O试剂盒染色，苏木素复染。斑块区域的面积评估采用Image Pro Plus version 6 (Media Cybernetics，Bethesda，MD)分析，以斑块占动脉管腔横截面的面积比来表示斑块相对大小。

4 HMGB1免疫组化 主动脉窦冷冻切片后，将剩余组织于4%多聚甲醛固定24 h，脱水并石蜡包埋，连续石蜡切片(4μm thick)，每间隔10张收集1张，每只小鼠共5张。石蜡切片常规脱蜡置水，柠檬酸钠缓冲液98℃，20 min抗原修复。PBS充分淋洗后，3% H2O2封闭内源性过氧化氢酶10 min，PBS充分淋洗后，山羊血清封闭10 min，兔抗小鼠HMGB1抗体(1∶100稀释)4℃孵育过夜。PBS充分淋洗后，二抗(山羊抗兔)孵育10 min，PBS充分淋洗后，三抗孵育10 min，PBS充分淋洗后，DAB镜下显色，适时终止显色，苏木素复染，脱水后中性树脂封片，于显微镜下观察、拍照。Image Pro Plus version 6对其进行定量分析。

5 巨噬细胞免疫组化 采用冷冻切片，切片经PBS淋洗后，0.1% Trition孵育透膜15 min，PBS充分淋洗后，3% H2O2封闭内源性过氧化氢酶10 min，PBS充分淋洗后，山羊血清封闭10min，MOMA-2，巨噬细胞特异性抗体(1∶50稀释)4℃孵育过夜。PBS充分淋洗后，二抗(山羊抗大鼠)孵育10 min，PBS充分淋洗后，三抗孵育10 min，PBS充分淋洗后，DAB镜下显色，适时终止显色，苏木素复染，脱水后中性树脂封片，于显微镜下观察、拍照。

6 统计学处理 所得数据均用SPSS19.0统计软件处理，数据用表示，组间资料比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 HMGB1在小鼠主动脉及动脉粥样硬化斑块中的表达 HMGB1表达在正常小鼠主动脉中，主要表达在内皮细胞胞核。在ApoE-/-小鼠主动脉中，广泛表达于内膜及内膜下，平滑肌细胞胞核亦有少量表达(图1)。

2 HMGB1在ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块中不同时期的表达 ApoE-/-小鼠早中期动脉粥样硬化斑块(10周)HMGB1的表达要比晚期(20周) HMBG1的表达含量高(图2)。定量分析动脉粥样硬化早中期斑块内HMGB1表达平均光密度为0.050±0.067，动脉粥样硬化晚期斑块内HMGB1表达平均光密度为0.020±0.053，两者差异有统计学意义(P＜0.05)。

3 ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块大小及斑块内巨噬细胞分布 早中期斑块面积比为0.25±0.02，晚期斑块面积比0.40±0.03，两者差异有统计学意义(P＜0.05)。巨噬细胞分布于内膜下，是斑块的主要成分(图3)。

讨 论

本研究利用免疫组化方法对HMGB1在小鼠主动脉中分布进行研究，并联合巨噬细胞染色，探讨HMGB1与斑块内内炎症的相关性。研究发现，正常小鼠中HMGB1主要表达于内皮细胞细胞核，结合既往研究，正常组织中HMGB1作为核蛋白稳定DNA结构，当内皮细胞受损时，可释放HMGB1作为炎症介质，增加黏附因子VCAM-1等的表达，从而使炎症细胞黏附并迁移进入内膜下[4,9-10]。在Kanellakis等[11]的研究中，对高脂喂养ApoE-/-小鼠主动脉窦行冷冻切片进行HMGB1免疫组化染色时，发现HMGB1广泛分布于内膜中。我们采用石蜡切片，更好地保持了组织的抗原性及结构，清晰地展示了HMGB1在动脉粥样硬化斑块内重点分布于内皮细胞。与HMGB1对内皮细胞功能影响的研究一致[9]，证实HMGB1可能参与斑块形成进展时内皮细胞功能的调控。而且，我们在中膜平滑肌细胞中也发现了少量HMGB1的表达，为HMGB1对平滑肌细胞功能调控提供了证据。

图 1 HMGB1在小鼠主动脉中表达A：对照组中，HMGB1主要表达内皮细胞细胞核； B：实验组中，广泛表达于内膜及内膜下，平滑肌细胞胞核亦有少量表达Fig. 1 HMGB1 expression in aorta of mice A: HMGB1 in aorta of normal mice mainly expressed in the endothelial cells nucleus; B: HMGB1 in aorta atherosclerotic plaques of ApoE-/- mice mainly expressed in nucleus and cytoplasm of endothelial cells and macrophages, and also a small amount smooth muscle cell nuclei

图 2 HMGB1在动脉粥样硬化不同时期表达 A：动脉粥样硬化早期； B：动脉粥样硬化晚期； C：HMGB1在斑块内的定量分析，每组n=6Fig. 2 HMGB1 expression at different stages of atherosclerosis A: HMGB1 expression at early and medial stage of atherosclerosis; B: HMGB1 expression at late stage of atherosclerosis; C: Quantitative of HMGB1 expression at different stages of atherosclerosis. 6 in each group

图 3 ApoE-/-小鼠不同时期主动脉斑块大小及巨噬细胞分布A：早中期斑块； B：晚期斑块； C：早中期斑块内巨噬细胞； D：晚期斑块内巨噬细胞； E：不同时期斑块大小对比，每组n=6Fig. 3 Aortic plaque size and distribution of macrophages of ApoE-/- mice at different atherosclerosis stages A: Aortic plaque size at early and medial atherosclerosis stage; B: Aortic plaque size at late atherosclerosis stage; C: Macrophages distribution at early and medial atherosclerosis stage; D: Macrophages distribution at late atherosclerosis stage; E: Comparison of relative area of AS lesion. 6 in each group

我们的研究发现，早中期斑块的HMGB1表达要比晚期斑块稍强。对斑块HMGB1免疫组化分析可以发现，HMGB1主要集中表达在内皮细胞及内皮细胞下巨噬细胞、泡沫细胞中；而胆固醇结晶附近脂核中心，HMGB1表达并不高。我们猜测，在斑块早中期，斑块内泡沫细胞含量多[12]，这个时候表达了大量HMGB1，促进斑块进一步形成。在斑块晚期，由于泡沫细胞大量坏死，形成了大脂核坏死中心[13]，故其在晚期表达水平不如早中期。从免疫组化中亦可发现，斑块晚期的HMGB1仍然主要集中在内皮细胞及内皮下细胞。正是大量泡沫细胞凋亡坏死，释放出大量HMGB1，与炎症细胞本身分泌的HMGB1一起启动了HMGB1介导的炎症反应，加重了斑块进展[6]。

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Distribution and expression of high mobility group box 1 in atherosclerotic plaques of mice

XIAO Hu'nan, LIU Hongbin, HOU Congcong, YU Qian
Department of Geriatric Cardiology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China Corresponding author: LIU Hongbin． Email: liuhbin301@sohu．com

ObjectiveTo study the distribution of high mobility group box 1 (HMGB1) in aorta of normal mice and aorta atherosclerotic plaque of high fat fed ApoE-/-mice and its expression in atherosclerosis at different stages．MethodsTwelve 8-weekold SPF C57BL/6 male mice and twelve C57BL/6 ApoE-/-male mice were used as control group and experimental group, each group was divided into two subgroups, the early and medial stage group (10 weeks high fat diet) and late stage group (20 weeks high fat diet)． After feeding for 10 weeks and 20 weeks, the mice were sacrificed． Aortic sinus frozen sections for oil red O staining was used to assess plaque size, macrophage immunohistochemical staining for localization of macrophages and aortic sinus paraffin sections for immunohistochemical staining to detect the expression of HMGB1．ResultsHMGB1 in normal mice aorta mainly expressed in endothelial cells nucleus, while in aorta atherosclerotic plaques of ApoE-/-mice it mainly expressed in nucleus and cytoplasm of endothelial cells and macrophages, and also a small amount in smooth muscle cell nuclei; HMGB1 expression in early and medial stage atherosclerosis was higher than advanced atherosclerosis (0．05±0．067 vs 0．02±0．053)． Atherosclerotic plaque area ratio in advanced stage was higher than early stage (0．40±0．03 vs 0．25±0．02)． Macrophages were located in the intima, as the main component of plaque．ConclusionHMGB1 in atherosclerotic plaques mainly expresses in endothelial cells and macrophages; The expression of HMGB1 in atherosclerosis is higher in early and medial stage than advanced stage．

high mobility group box 1; atherosclerosis; inflammation

R 543

A

2095-5227(2015)12-1236-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.12.020

时间：2015-09-24 09:48:22

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150924.0948.006.html

2015-05-27

肖湖南，男，在读硕士。研究方向：心血管疾病的诊治及预防。Email: xiaohunan0804@163.com

刘宏斌，男，主任医师。Email: liuhbin301@sohu.com