波生坦对糖尿病小鼠心肌组织纤维相关生长因子的影响

赵 华，李传威，张 健，杨 波

解放军总医院 心血管内科，北京 100853

波生坦对糖尿病小鼠心肌组织纤维相关生长因子的影响

赵 华，李传威，张 健，杨 波

解放军总医院 心血管内科，北京 100853

目的探讨波生坦对糖尿病小鼠心肌组织纤维相关生长因子的影响。方法将6周龄雄性C57BL/6小鼠分为3组：对照组、糖尿病组、糖尿病+波生坦组，每组15只。链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)按70 mg/kg单次剂量腹腔注射。在STZ注射后即刻、1周、2周测定小鼠的空腹血糖，以确定糖尿病模型是否建立。在STZ注射后第2天糖尿病+波生坦组小鼠灌胃波生坦(100 mg/kg)，其余两组灌胃等量的0.9%氯化钠注射液直到16周。应用反转录酶-聚合酶连锁反应检测转化生长因子(transforming growth factor beta，TGF-β)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及胶原蛋白1(Collagen-1)的mRNA的表达。结果16周后，测量小鼠空腹血糖，糖尿病组与糖尿病+波生坦组接近(P＞0.05)，两组血糖与对照组相比显著增高(P＜0.01)。糖尿病+波生坦组心脏VEGF的mRNA水平较糖尿病组增高(P＜0.05)，糖尿病+波生坦组与糖尿病组相比，心肌纤维相关因子TGF-β、CTGF及Collagen-1的mRNA水平较低(P＜0.05)。结论内皮素受体拮抗剂波生坦能降低心肌纤维相关生长因子的表达。

波生坦；糖尿病；纤维相关生长因子；C57BL/6小鼠

长时间处于糖尿病状态会导致小血管及微血管结构和功能发生改变，同时也会引起许多糖尿病相关并发症，例如脑血管疾病、糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病、糖尿病周围血管病变、动脉粥样硬化等。糖尿病是心血管疾病的独立危险因素[1]，能够引起细胞外基质产生，细胞外基质的改变已被证实为心肌病结构性改变的标志。细胞外基质的形态学及生物化学性质的紊乱与心功能降低直接相关[2]。细胞外基质由胶原蛋白、弹性蛋白、糖蛋白、水和蛋白多糖及整合素等组成，这一结构不仅支持细胞的生存，而且起到调节细胞间及细胞与血管组织的细胞外基质的交互作用[3]。1型和3型胶原蛋白都出现在正常和异常的心肌组织中，但是1型胶原蛋白(Collagen-1)占有主导地位。1型胶原蛋白对增加左心室重量和弥散心肌纤维化起到重要作用，甚至在中度高血糖的糖尿病中会出现心肌细胞肥大和心肌间质纤维化[4]。生长因子如转化生长因子(transforming growth factor beta，TGF-β)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)、胰岛素样生长因子1，纤维母细胞生长因子、表皮生长因子在糖尿病并发症中起重要作用。TGF-β与CTGF参与细胞外基质的积聚，VEGF在血管的形成过程中起着重要的作用，同时也促进损伤组织的修复[5]。内皮素-1是一种强效收缩肽，起到促进纤维化的作用。高血糖可促进内皮素-1受体上调，在心肌细胞肥大中，内皮素-1与细胞外基质积聚有关[6]。本实验主要探究VEGF、TGF-β、CTGF和Collagen-1在糖尿病小鼠中的改变及波生坦对于糖尿病心肌纤维相关生长因子的潜在保护效应。

材料和方法

1 实验动物 本实验符合实验动物研究指南[7]，实验程序遵循解放军总医院动物实验中心管理指南，并通过伦理委员会审查。雄性C57BL/6小鼠45只饲养在解放军总医院动物实验中心屏障实验室，环境温度：24℃，相对湿度：50% ～ 60%，光照：12 h/12 h明暗交替，噪声＜50 db，所有的小鼠都给予相同的食物和水。

2 小鼠糖尿病模型建立 在一整夜的禁食后，糖尿病组和糖尿病+波生坦组注射链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)。STZ溶解在柠檬酸钠缓冲溶液(pH=4.2)中，按70 mg/kg单次剂量腹腔注射，对照组注射等量的柠檬酸缓冲溶液。使用血糖仪在STZ注射后即刻及1周、2周、16周测定小鼠的空腹尾静脉血糖，并比较各组血糖之间的差异，空腹血糖＞16.8 mmol/L即糖尿病模型建立成功。

3 分组处理 C57BL/6雄性小鼠在6周龄时随机分为3组，对照组(n=15)、糖尿病组(n=15)、糖尿病+波生坦组(n=15)。在STZ注射后第2天第3组小鼠灌胃波生坦(100 mg/kg)，其余两组灌胃等量的0.9%氯化钠注射液(每天灌胃1次)，直到第16周处死所有小鼠，取出心肌组织，并用Real time PCR检测心肌纤维相关因子的表达。

4 Real time PCR分析小鼠心肌组织中的TGF-β、CTGF、VEGF和Collagen-1的mRNA表达 用超纯RNA提取试剂盒(CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0581)提供的操作步骤提取3组小鼠心肌组织中总RNA。取5μl RNA用1%琼脂糖凝胶进行电泳，以检测RNA的完整性。用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。用UltraSYBR Mixture(With ROX)(CWbio. Co.Ltd，Cat#CW0956)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增程序：95℃10 min，(95℃15 s，60℃60 s)×45个循环。Real Time反应体系：2×UltraSYBR Mixture：10μl，上游引物(10μmol/ L)：0.4μl，下游引物(10μmol/L)：0.4μl，模板：2μl，加入灭菌蒸馏水至20μl。以正常心肌组织为校正样本，反应体系以甘油醛232磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参照，VEGF引物序列：上游引物5'-TGTGCAGGCTGCTGTAACGATGA-3'，下游引物5'-GTGCTGGCTTTGGTGAGGTTTGAT-3'；TGF-β引物序列：上游引物5'-CTCCCGTGGCTTCTAGT GC-3'，下游引物5'-GCCTTAGTTTGGACAGGATC TG-3'；CTGF引物序列：上游引物5'-GCCTGTTC TAAGACCTGTGGGATGG-3'，下游引物5'-TAGCC CTGTATGTCTTCACACTGGT-3'；Collagen-1引物序列：上游引物5'-GAACATCCGCAGCCCCGAA-3'，下游引物5'-CGATCCAGTACTCTCCGCTCT-3'；GAPDH引物序列：上游引物5'-ACCACAGTCCA TGCCATCAC-3'，下游引物5’-TCCACCACCCTGT TGCTGTA-3'。

5 统计学方法 所有数据使用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。定量数据用表示，TGF-β、CTGF、VEGF和Collagen-1的mRNA表达水平用方差分析，两组间有差异的采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 空腹血糖的比较 检测3组小鼠注射STZ后即刻、1周、2周及16周的尾静脉血糖值，注射后即刻各组空腹血糖水平差异无统计学意义(P＞0.05)。在1周、2周及16周时糖尿病组及糖尿病+波生坦组与对照组相比空腹血糖水平差异有统计学意义(P＜0.05)，糖尿病组与糖尿病+波生坦组相比空腹血糖水平差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 3组小鼠血糖的比较Tab. 1 Comparison of FBG in mice of three groups (mmol/L)

表2 Real-time PCR 检测小鼠心肌组织mRNA表达Tab. 2 Comparison of mRNA of myocardial tissue in mice expression by real-time PCR

2 Semiquantitative RT-PCR检测各组小鼠心肌组织中TGF-β、CTGF、VEGF和Collagen-1的mRNA表达 与对照组比较，糖尿病组VEGF的mRNA表达下降，TGF-β、CTGF和Collagen-1的mRNA表达均升高。与对照组比较，糖尿病组与糖尿病+波生坦组VEGF表达下降(P＜0.05)(图1)。与对照组比较，糖尿病组与糖尿病+波生坦组TGF-β、CTGF和Collagen-1表达升高(P＜0.05)。与糖尿病组相比，TGF-β、CTGF和Collagen-1在糖尿病+波生坦组表达下降(P＜0.05)。见表2。

图 1 半定量实时聚合酶链反应对小鼠心肌组织的分析Fig. 1 Semiquantitative real-time PCR analysis of myocardial tissue in mice

讨 论

本研究发现，内皮素受体拮抗剂波生坦在糖尿病小鼠中能够调节纤维相关生长因子的异常表达。有研究发现，糖尿病心肌纤维化部分原因是由于激活了内皮系统，导致心肌和血管功能和结构的异常[8]。内皮素受体拮抗剂波生坦对糖尿病心血管并发症具有潜在的保护作用[9]。

本研究表明，糖尿病小鼠心脏的VEGF表达下降，纤维相关因子的表达(TGF-β、CTGF和Collagen-1)升高。先前的研究表明，在STZ诱导的动物模型中，心肌的VEGF的mRNA表达水平有极大程度的下降。在糖尿病患者尸体检测心脏的VEGF，与非糖尿病患者相比双倍下降[10]。本研究观察到，VEGF在所有糖尿病小鼠中的表达都是下降的，用波生坦治疗过的糖尿病小鼠的VEGF表达升高。然而，糖尿病中内皮系统与VEGF相关的确切机制还不是很清楚。现已经证实，无论是在糖尿病的早期还是晚期阶段，细胞外基质聚集与TGF-β和CTGF相关[11]。几种实验和临床证据都表明，TGF-β在糖尿病的心肌间质的纤维化过程中起着重要的作用[12-13]。在心肌纤维化过程中另一个重要的纤维生长因子是CTGF，无论是1型还是2型糖尿病动物模型中，CTGF的mRNA在心肌的表达都是升高的[14]。在糖尿病中，Collagen-1促进心肌的细胞外基质产生与聚集[15]。本研究表明，内皮素受体拮抗剂波生坦能够降低TGF-β、CTGF和Collagen-1的异常表达，同时能够保留VEGF的表达功能，因此波生坦可能在减轻心肌纤维化中起着一定的作用。

糖尿病对内皮系统的激活起着重要的作用，无论是在糖尿病的动物模型还是在糖尿病病人中[16-17]，血浆中内皮素水平都是升高的。另外已有报道，内皮素受体拮抗剂在糖尿病的实验中能够减少细胞外基质蛋白产生[18]。因此，治疗、干预、抑制内皮系统在减轻糖尿病相关的心血管并发症中可能起着重要的作用。本研究表明，内皮素受体拮抗剂波生坦可在糖尿病小鼠中减轻纤维相关因子的表达，并改善VEGF的表达水平。本研究存在一定的限制，我们没有检测治疗前后血浆中内皮素的水平及应用病理学去检测心肌的纤维程度，本研究主要用来设计检测波生坦是否能够减轻心肌组织纤维相关因子的异常表达。更进一步的检测心脏功能及心肌组织病理改变将会在后续研究中进行。

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Effect of Bosentan on expression of fibrotic related growth factors of myocardial tissue in diabetic mice

ZHAO Hua, LI Chuanwei, ZHANG Jian, YANG Bo
Department of Cardiology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

YANG Bo． Email: dryangb@aliyun．com

ObjectiveTo explore the effect of Bosentan on the expression of fibrotic related growth factors of myocardial tissue in diabetic mice．MethodsMale 6-week old C57BL/6 mice were divided into 3 groups: control group, diabetes mellitus (DM) group and DM-B group (diabetes with bosentan group), 15 in each group． Streptozotocin (STZ) was injected intraperitoneally accounting for 70 mg/kg for single dose which was used to confirm that diabetes was induced in the mice, fasting blood glucose (FBG) was measured at 0-, 1-, 2-week after STZ injection． The second day after STZ injection, mice in DM-B group underwent intragastric administration of Bosentan (100 mg/kg), mice in the rest of the two groups were injected with the same amount of saline lavage for 16 weeks． RT-PCR was applied to detect transforming growth factor beta (TGF-β), connective tissue growth factor (CTGF), vascular endothelial growth factor (VEGF) and the expression of RNA (mRNA) which was the messenger of collagen protein 1 (collagen - 1)．ResultsAfter 16 weeks, fasting blood glucose in mice of DM group and DM-B group was measured which was similar without significant differences (P＞0．05), but it was significantly higher in these two groups when compared with control group (P＜0．01)． Compared with DM group, the cardiac VEGF mRNA level in DM-B group was significantly higher (P＜0．05), and the expression of fibrotic related growth factors TGF-β, CTGF and collagen-1 was significantly lower (P＜0．05)． Conclusion These findings suggest that endothelin receptor antagonists Bosentan can reduce the expression of fibrotic related growth factors of myocardial tissue in diabetic mice．

Bosentan; diabetes mellitus; fibrotic related growth factors; C57BL/6 mice

R 587.1

A

2095-5227(2015)12-1214-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.12.015

时间：2015-09-24 09:39:24

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150924.0939.002.html

2015-06-17

北京市自然科学基金项目(7132227)

Supported by the Beijing Natural Science Foundation of China (7132227)

赵华，男，在读硕士。研究方向：应用内皮素受体拮抗剂治疗糖尿病小鼠心肌纤维化的机制研究。Email: 977969009@qq. com

杨波，男，副主任医师，副教授，硕士生导师。Email: dryangb@aliyun.com