破骨前体细胞在骨吸收中的作用和双光子显微镜活体观察破骨前体细胞的研究

谢 雍，张里程，吕厚辰，尹鹏滨，张立海，唐佩福

解放军总医院 骨科，北京 100853

破骨前体细胞在骨吸收中的作用和双光子显微镜活体观察破骨前体细胞的研究

谢 雍，张里程，吕厚辰，尹鹏滨，张立海，唐佩福

解放军总医院 骨科，北京 100853

近年来在骨质疏松和骨折愈合机制研究中，破骨细胞和破骨前体细胞在骨吸收中的相互作用越来越受到重视，被认为是未来药物治疗骨质疏松乃至其他骨质破坏疾病的关键策略和重要靶点。本文综述了趋化因子-1通路(CX3CL1-CX3CR1 pathway)和1-磷酸鞘氨醇信号(S1P signal)及其受体在破骨细胞和破骨前体细胞间调控作用的最新研究进展。同时还对最近文献中出现的使用双光子显微镜活体观察破骨细胞和破骨前体细胞的方法进行了介绍，该方法被认为开启了骨科研究领域的新时代。

破骨前体细胞；1-磷酸鞘氨醇；趋化因子1受体；双光子显微镜

骨是人体中高度活跃的器官，处在破骨细胞主导的骨破坏和成骨细胞主导的骨形成的动态平衡中[1]，这种平衡受到机体内分泌系统和免疫系统的调控。在骨受到损伤或是发生炎症和产生肿瘤的情况下，这种动态平衡就会被打破。主要表现为骨质破坏作用和骨质吸收作用增强，造成骨质的丢失，随之产生一系列症状和体征[2]。而在骨质疏松和骨折愈合过程中，这种动态平衡的紊乱和其病理生理变化还没有被完全阐明[3]。研究者越来越关注其中的调控机制，以求能够找到新的治疗靶点和选择更有效的治疗方法。传统方法研究破骨细胞和破骨前体细胞相互作用机制只能通过标本观察，受制于时空特性，不能有效地观察到活体内实际的细胞运动[4]。而随着绿色荧光蛋白标记趋化因子-1受体(CX3CR1-EGFP)杂合转基因小鼠和双光子显微镜技术的不断成熟，活体观察破骨前体细胞的分化迁移过程成为了可能。近期Ishii等通过双光子显微镜和遗传修饰动物对S1P在活体内对破骨前体细胞的调控作用进行了观察和研究。下面就对以上研究的进展和采用的研究方法做一综述。

1 破骨细胞和成骨细胞在骨重塑中的作用

破骨细胞和巨噬细胞同源于造血干细胞，并且共用一种前体细胞。成骨细胞则是来源于间叶组织干细胞系[5]。后有研究证明，破骨前体细胞表达NF-κB受体激活蛋白(receptor activator of nuclear factorκB，RANK)，其配体是κB受体激活蛋白配体(receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL)，是来自于由干细胞分泌的肿瘤坏死因子家族的一类三聚体[6]。破骨细胞和成骨细胞在骨重塑过程中具有紧密的关系，破骨前体细胞附着到骨表面后，在RANKL的刺激下分化成为成熟的破骨细胞，开始产生骨吸收作用，同时引发成骨细胞分化，在已经破坏的骨质上重建骨细胞，形成新骨[7]。该过程被分为3个阶段[1]，起始阶段开始于造血前体细胞的聚集，破骨细胞分化由成骨细胞表达的RANKL诱导产生，成熟的破骨细胞开始骨吸收作用[8]；而过渡阶段则以通过偶联因子完成的骨重塑转换为标志，这一阶段中还存在着破骨细胞的凋亡[9]；结束阶段中，新骨在成骨细胞诱导的骨重塑作用中将被破骨细胞吸收的骨质空隙填满，随后进入静止期[10]。其中破骨前体细胞分化为破骨细胞的过程被认为受多种生长因子和激素的影响，如甲状旁腺激素，主要通过影响巨噬细胞集落刺激因子(macrophagecolony-stimulating factor，M-CSF)和RANKL的表达来影响破骨前体细胞的分化[11]。日本学者最先报道了CX3CL1-CX3CR1通路在破骨细胞分化中的作用，随后又有学者进一步阐释了该通路在维持骨质动态平衡中的机制[12]。

2 破骨前体细胞向破骨细胞的分化

破骨前体细胞向破骨细胞的分化过程是在一系列特殊因子的调控下完成的，其中M-CSF和RANKL是两种主要的因子，它们通过激活多重细胞内信号通路来调控破骨细胞基因的转录和表达[11]。M-CSF是破骨前体细胞增殖和存活的关键因子。是由成骨细胞和基质细胞生成，并与表达在早期破骨前体细胞上的巨噬细胞集落刺激因子受体(macrophagecolony-stimulating factor receptor，M-CSFR)识别[13]。M-CSF还通过激活小眼相关转录因子(Microphthalmia-associated transcription factor，Mitf)作为破骨前体细胞的存活因子，并刺激破骨前体细胞表达RANK[14]。

RANKL-RANK通路使多种破骨细胞基因表达，包括抗酒石酸酸性磷酸酶和基质金属蛋白酶9。而RANKL，作为肿瘤坏死因子α家族的一员，是在诸如维生素D3、甲状旁腺激素等激素和因子的诱导下由成骨细胞和基质细胞产生的[15]。骨保护素作为一种可溶性的饵受体可以阻止RANKL-RANK通路[16]。在破骨细胞形成过程中，RANKL和RANK的结合会诱导肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis actor receptor associated factors，TRAFs)到RANK的细胞质，进而刺激下游信号，包括核转录因子κB和活化T细胞核因子1蛋白[17]。

3 CX3CL1-CX3CR1通路对于破骨细胞和破骨前体细胞的调控

趋化因子-1(Fractalkine，CX3CL1)是一种兼有黏附和趋化活性的趋化因子。其主要作用为趋化和激活白细胞，参与炎症反应[12]。在趋化因子家族中，根据其氨基端保守半胱氨酸残基的数目和间隔的结构特点，可分为4个亚族，即CC，CXC，C和CX3C族。在CX3C族中已知的趋化因子是人的Fractalkine，鼠的同系物称为神经趋化因子(neurotactin)。Fractalkine与其他趋化因子的最大区别在于它是一种跨膜糖蛋白[18]。Fractalkine的一种高亲和力受体CX3CR1，趋化因子β受体类似物-1，属于趋化因子受体超家族，具有7次跨膜G-蛋白偶联结构域。其基因位于染色体3p21-3pter，邻近CCR的基因族。将小鼠的CX3CR1基因用绿色荧光蛋白(greenfluorescent protein，GFP)报告基因替代后，小鼠存活并发育为成鼠，无自发的特异性改变[19]。

据Koizumi等[12]报道，CX3CL1在成骨细胞诱导的破骨细胞分化中作为CX3CR1特异性配体。他们发现破骨前体细胞选择性地表达CX3CR1，而CX3CL1是由成骨细胞表达。可溶性的CX3CL1诱导包括破骨前体细胞在内的骨髓细胞的迁移，不可溶的CX3CL1则调控着破骨前体细胞的的黏附作用。他们进一步研究用单克隆抗体(MAB)阻断CX3CL1可以有效地抑制破骨前体细胞分化，并且通过降低成熟破骨细胞的数量显著降低了骨吸收。由此认为该通路可以成为骨吸收疾病治疗干预的重要靶点。

Hoshino等[20]在现有的理论基础上，通过研究CX3CR1基因缺陷小鼠，进一步阐述了CX3CL1-CX3CR1通路在活体骨代谢中的生理作用。他们发现这种CX3CR1基因缺陷小鼠表现出显著的成骨反应，破骨细胞的数量明显下降，骨皮质和骨小梁的密度有所提高。破骨细胞相关基因的转录水平也明显下降。进一步的体外免疫荧光染色实验表明，CX3CL1-CX3CR1通路主要在成骨细胞分化的早期阶段起作用。并且指出，该通路的主要作用是维持破骨前体细胞的聚集而不是诱导分化破骨细胞。

Han等[21]研究鼠骨的电离辐射模型，进一步报道CX3CL1-CX3CR1通路并不调控破骨细胞的分化，而是促进破骨细胞的聚集，从而加强骨吸收作用。并观察到，无论是CX3CL1还是CX3CR1都没有像其他趋化因子一样的交叉作用和相互影响，这种独立的作用易于成为治疗骨质丢失的干预靶点。

另有研究表明，趋化因子-12通路(CXCL12/SDF-1-CXCR4 pathway)也能促进破骨前体细胞的趋化聚集和发展存活，CXCL12/SDF-1大量存在于骨髓腔的血管周边有炎性破坏的区域，而CXCR4则在破骨前体细胞表面大量表达[22]。

4 Sphingosine-1-phosphate信号控制破骨细胞和骨的动态平衡

首先，破骨细胞是来源于体内单核巨噬细胞系中的前体单核细胞的分化，这种分化需要两种重要的分子：M-CSF和RANKL。尽管破骨前体细胞在什么阶段迁移到骨表面还存在争议，但已有研究表明，S1P扮演了重要角色[23]。

S1P是生物活性神经鞘磷脂的代谢产物，调控多种的生物功能。在生物组织中的含量相对较低，主要由血管内皮细胞合成，在血浆内大量的存在[23]。S1P信号是通过5种7次跨膜的G蛋白偶联受体转导的，1-磷酸鞘氨醇受体(S1PR1 to S1PR5)。而S1PR1和S1PR2在调控细胞迁移时，根据S1P梯度的不同产生相反的作用[22]。

日本学者Ishii等[24]利用活体双光子显微镜技术揭示了S1P控制破骨前体细胞在骨组织和血流中迁移的重要作用。通过使用一种活体内双光子显微镜，在荧光蛋白标记技术的帮助下，可以观察到S1P在血液中浓度较高，这时S1PR2表现出一种趋化排斥作用，诱导破骨前体细胞进入S1P浓度较低的骨髓腔内；而进入骨髓腔内的破骨前体细胞，由于低S1P浓度的作用，S1PR1则表现出趋化吸引作用，使破骨前体细胞由骨髓腔回到血管内[25]。另外，一部分进入骨髓腔的破骨前体细胞，在成骨细胞表达的RANKL刺激下，附着在骨表面，分化为成熟的破骨细胞，进而加强骨吸收作用。

为了进一步验证该作用，学者分别研究了S1PR1基因敲除小鼠和S1PR2基因敲除小鼠。发现S1PR1基因敲除小鼠的股骨密度明显低于正常对照组，双光子显微镜下骨标本的破骨前体细胞在骨表面的黏附聚集显著高于正常对照小鼠[26]。S1PR2基因敲除小鼠的破骨细胞骨吸收作用明显低于正常小鼠，而体外的破骨细胞形成没有受到显著影响[27]。

5 双光子显微镜活体观察破骨细胞和破骨前体细胞的应用

在激光照射下，基态荧光分子或原子同时吸收两个光子而成激发态，这就是双光子激发过程。将双光子技术与各种显微镜技术相结合，在生物医学领域发挥了重要作用，主要用于对神经细胞和递质的观察和研究[4]。双光子荧光远离激发波长，避免了激发光对荧光探测的影响，能实现暗场成像，背景噪声小，图像对比度高；焦点以外不发生漂白现象；可用红外或近红外激光作光源，红外光在生物组织中的穿透力强，能对生物组织的深层进行观察成像[27]。

钙磷作为骨组织的主要构成成分非常容易散射激光束，即使利用近红外激光也很难观察较厚的骨组织。研究者选用了鼠颅骨作为观察对象，因为颅骨的表面到骨髓腔的距离为80 ～ 120μm，刚好是双光子显微镜适合的观察深度[28]。

将CX3CR1-EGFP杂合转基因小鼠用异氟醚麻醉，头顶部去除皮肤并固定，以便于使用双光子显微镜进行观察[25]。血管通过静脉注射得克萨斯红色高分子共轭葡聚糖显示红色。骨通过第2谐波荧光信号(second-harmonic generation)显示为蓝色。CX3CR1已被证明在破骨前体细胞中稳定表达[12]，所以绿色荧光蛋白标记的CX3CR1-EGFP作为观察破骨前体细胞的替代，显示为绿色。研究人员对小鼠静脉注射一种S1PR1的强力兴奋剂SEW2871[29]，观察到破骨前体细胞受到刺激并移动到血管中；S1PR2的强力拮抗剂JTE013[30]静脉注射到小鼠体内后，也确实观察到破骨前体细胞(即CX3CR1-EGFP)迁移回到血系中，而这种作用不如SEW2871的作用显著。进一步验证了S1P在对破骨前体细胞在血系和骨质间迁移的作用。盐酸芬戈莫德(FTY720)作为4种S1PR的拮抗剂，能够缓解卵巢切除小鼠的骨质疏松，这种作用是通过减少成熟破骨细胞在骨表面的数量完成的[31]。学者以此推断调控破骨前体细胞的迁移将会是未来临床的策略。

日本学者利用自己设计的荧光探针BAp-E，在活体内产生的低pH环境下动态的显示破骨细胞骨吸收的过程[32]。德国学者利用双光子显微镜活体观察技术，发现β-磷酸三钙骨替代材料的体外降解不仅被破骨细胞影响，也受到巨噬细胞的吞噬[4]。

6 结语

我们看到控制和抑制破骨前体细胞对于调控骨吸收作用是一个很有前途的方向。使用双光子显微镜活体观察S1P受体基因敲除动物和使用S1P拮抗药物干预后野生型动物的破骨前体细胞和破骨细胞的运动分化特点，有可能会找到S1P和S1P受体间相互作用的特点，进一步验证该通路的正确性，排除其他因素的影响，确定靶点，选择特异性更高的靶向药物。

CX3CL1-CX3CR1通路和S1P通路之间在破骨前体细胞迁移乃至整个骨吸收重塑过程中存在怎样的相互联系，他们之间是如何进行调控的，还没有相关报道。利用双光子显微镜在活体中观察两种通路的相互作用也许会有新的发现。但是因为双光子显微镜目前很难观察厚组织和荧光标记物，目前对破骨细胞和破骨前体细胞的观察还只能在鼠颅骨上进行。并且因为观察的需要，要剔除顶部皮肤，使颅骨暴露，难免会造成观察部位的损伤和其他理化因素的影响。这些操作对实验结果准确性必然会造成一定影响。如何采用科学的实验设计尽量避免这些因素的影响，也是未来需要解决的问题。

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Role of osteoclast precursors in bone resorption by two-photon microscope in vivo

XIE Yong, ZHANG Licheng, LYU Houchen, YIN Pengbin, ZHANG Lihai, TANG Peifu
Department of Orthopedics, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

TANG Peifu． Email: pftang301@126．com

Recently, the interaction between osteoclast precursors and osteoclasts in osteroprosis and bone fracture healing has drawn more and more attention, which is considered to be the key therapeutic target in treating osteroprosis and other bone destruction diseases． This paper reviews the mechanism of the bone resorption, particularly focusing on the latest research progress regarding the regulatory function of CX3CL1-CX3CR1 pathways and S1P signal． And it also summarizes the method which involves two-photon microscope observation of osteoclasts and osteoclast precursor in vivo, which is considered to be able to open a new era in the field of orthopedic research．

osteoclast precursors; sphingosine-1-phosphate; CX3C chemokine receptor 1; two-photon microscope

R 336

A

2095-5227(2015)12-1246-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.12.023

时间：2015-07-17 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150717.1029.004.html

2015-05-11

国家自然科学基金面上项目(31271000；81401809)；博士后科学基金(2014M562549)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(31271000; 81 401809); China Postdoctoral Science Foundation(2014M562549)

谢雍，男，硕士。研究方向：创伤骨科。Email: xysunflower @yeah.net

唐佩福，男，博士，主任医师，教授。Email: pftang301@ 126.com