聚合酶链反应检测梅毒螺旋体的应用进展

薛耀华 杨斌 郑和平

聚合酶链反应检测梅毒螺旋体的应用进展

薛耀华 杨斌 郑和平

梅毒的诊断主要依据临床表现，血清学检测和梅毒螺旋体暗视野检查。随着人们对梅毒螺旋体基因组的认识，已经建立了多种基于梅毒螺旋体特异性基因序列的聚合酶链反应检测方法，常规聚合酶链反应、巢式聚合酶链反应、反转录聚合酶链反应、多重聚合酶链反应和实时荧光聚合酶链反应可以检测多种不同类型的临床标本，用于梅毒螺旋体的基因检测。聚合酶链反应扩增的靶基因有tpp47、polA、bmp、tmpA、arp、tpr等，其中tpp47、polA为常用的靶基因。皮损拭子、血液、脑脊液、病理组织、羊水等均可进行聚合酶链反应检测。

梅毒；苍白密螺旋体；聚合酶链反应；基因扩增；靶基因

梅毒是由梅毒螺旋体（Tp）感染引起的全身多系统疾病，近年来发病率呈逐年增加的趋势，已成为严重的公共卫生问题［1-2］。梅毒的防治主要在于早发现，早诊断和早治疗［3-4］。随着分子生物学技术的迅速发展，聚合酶链反应（PCR）在梅毒诊断和流行病学方面得到了不断地更新和完善。在过去的20多年里，已经建立了多种基于Tp特异性基因序列的PCR检测方法，可以检测多种不同类型的临床标本［5］。

作者单位：510515广州，南方医科大学南方医院检验系（薛耀华）；广东省皮肤性病防治中心（薛耀华、郑和平、杨斌）

1 Tp PCR检测类型

1.1常规PCR：Tp基因是由1138006个碱基对组成的环状DNA，有1 081个开放读码框架。常规PCR扩增后需做凝胶电泳对扩增产物进行鉴定，扩增产物容易造成假阳性污染，是早期广泛应用的基因诊断方法，但对Tp含量较低的标本敏感性较低［6］。

1.2 反转录PCR：是将1条RNA链反转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。Centurion-Lara等［7］用反转录 PCR检测 Tp16S rRNA，先反转录获得cDNA，再以cDNA为模板扩增366 bp的基因片段。

1.3 巢式PCR：利用两对PCR引物进行两轮PCR扩增反应，第2次PCR扩增片段短于第1次扩增片段。由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，增加了检测的敏感性；又有两对PCR引物与检测模板配对，从而增加了检测的可靠性。Grange等［8］收集拭子标本进行巢式PCR与暗视野显微镜检查，其中一期梅毒患者65例，二期梅毒44例，非梅毒患者43例，巢式PCR检测的敏感性为82%，特异性为95%；暗视野显微镜检查的敏感性为73%，特异性为88%。Grange根据Tp tpp47基因设计两对引物，第1次扩增片段长度为1 103 bp，以此PCR产物为模板，第2次扩增片段长度为168 bp，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行分析。由于巢式PCR进行2次PCR反应，操作较繁琐。

1.4 多重PCR：在同一PCR反应体系里有2对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。与常规PCR方法相比，多重PCR的主要特点是高效，在同一PCR反应管内能同时检出多种病原微生物。Scott等［9］设计 Tp、单纯疱疹病毒的特异性引物，用多重PCR检测692例生殖器溃疡标本，结果疱疹阳性275例，15例Tp阳性，1例梅毒和疱疹病毒双阳性。

1.5 实时荧光PCR：实时荧光PCR融合了PCR的高灵敏性、DNA分子杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量等优点，可直接探测PCR过程中荧光信号的变化以获得结果，不需要PCR后处理或电泳检测，完全闭管操作，避免了产物的污染。近年来，实时荧光PCR已经成为Tp PCR检测的主要方法，实时荧光PCR包括实时荧光定性PCR和实时荧光定量 PCR。Heymans等［10］扩增 Tp polA 基因，TaqMan探针5′端标记荧光染料FAM，3′端标记荧光淬灭基团BHQ-1，Ct值 <36判断为阳性结果。Tipple等［11］用实时荧光定量PCR技术扩增tpp47基因，应用SYBR GreenⅠ染料进行荧光定量，最低检出限为10 μl模板 DNA 中有 1 个 Tp DNA。 Cruz等［12］扩增Tp polA基因，用TaqMan探针技术进行PCR定量，探针5′端标记荧光染料Cy5，3′端标记荧光淬灭基团BHQ-3，该方法的检出限为每毫升全血标本中15～150个Tp。Cruz还检测全血标本，发现二期梅毒患者Tp拷贝数范围在194～1 954拷贝/ml。实时荧光定量PCR对于研究螺旋体在体内的感染量有重要意义。

2 PCR扩增的靶基因

2.1 tpp47基因：tpp47基因编码相对分子质量为47 000膜蛋白，常规PCR、巢式PCR和实时荧光PCR应用较多。tpp47基因在Tp亚种中均可高水平表达，而且是各种Tp亚种表达水平最高的基因之一，因此，是Tp检测最常用的PCR靶基因。Brustain［13］用常规PCR扩增螺旋体相对分子质量为47 000膜蛋白基因，羊膜液、新生儿血液和新生儿脑脊液的敏感性为78%。Gayet-Ageron等［14］应用实时荧光定性PCR检测tpp47基因，一期梅毒皮损拭子、全血、血清和尿液的敏感性分别为80%、28%、55%和29%；二期梅毒皮损拭子、全血、血清、尿液的敏感性分别为 20%、36%、47%和 44%。雷震山等［15］用巢式 PCR法对195例硬下疳棉拭子和血液标本中Tp特异性基因tpp47进行扩增检测，所有标本同时做暗视野镜检和Tp-ELISA血清学检测。结果显示，巢式PCR检测出阳性标本176例，其灵敏度和特异性分别为90.3%和100%。暗视野镜检和Tp-ELISA检测的灵敏度分别为82.1%和84.6%，特异性分别为85.8%和93.3%。

2.2 polA基因：polA即DNA聚合酶Ⅰ，比较Tp与其他微生物polA基因的同源性，发现polA基因非常独特，所有编码的半胱氨酸多达24个，占多聚酶氨基酸总数的2.4%，而绝大多数微生物只有l～2个，仅占0.1%，并有4个特殊的插入点，因而Tp polA基因具有较高的敏感性和特异性。Cruz等［12］应用实时荧光定量PCR技术扩增Tp polA基因。Castro等［16］设计了扩增Tptpp47基因和polA基因的引物，检测隐性梅毒患者的血液标本，tpp47基因的敏感性为39.1%，polA基因的敏感性为31.1%。张森淼等［17］以tpp47和polA为靶基因检测40例隐性梅毒患者全血、血浆和血清的Tp，结果tpp47检测全血、血浆、血清的DNA阳性率分别为30.0%、37.5%、20.0%，polA阳性率分别为22.5%、27.5%、15.0%，两种方法检测结果差异无统计学意义。Gayet-Ageron等［18］系统性评价了Tp扩增的靶基因，tpp47和polA为常用靶基因，在这两个位置设计引物扩增Tp，PCR阳性率差异无统计学意义。

2.3 其他靶基因：在早期梅毒PCR研究中，Bruisten［13］应用巢式PCR反应检测编码相对分子质量为39 000的膜蛋白bmp基因，收集372例生殖器溃疡拭子标本，PCR的敏感性为75.0%，特异性为100%；血清学检测的敏感性为43.8%，特异性为100%。PCR检测Tp并不仅局限于Tp DNA，16S rRNA和23S rRNA分子也可应用于Tp的检测。Centurion-Lara等［7］用反转录 PCR 检测 Tp 16S rRNA，可以检测到1个拷贝的梅毒螺旋体。Chen等［19］检测Tp阿奇霉素耐药的23S rRNA的A2058G和A2059G点突变。近年来arp和tpr作为靶基因应用于 Tp 基因分型研究［20］。

3 PCR检测标本类型

2013年世界卫生组织颁布的《性传播疾病包括人类免疫缺陷病毒实验室诊断》一书明确指出，Tp PCR检测的标本类型包括皮损、病理组织和体液等，这些样本可以是新鲜的、冻存的、固定的或石蜡包埋的［21］。目前国内外学者最常用的标本类型是一期梅毒患者生殖器溃疡分泌物样本和二期梅毒患者的血液样本。

Grange等［8］应用巢式 PCR技术扩增 tpp47基因，检测拭子和血液标本的Tp，其中一期梅毒87例，二期梅毒103例，早期隐性梅毒40例。对于有皮损的梅毒患者，用拭子收集组织液。如果二期梅毒患者没有溃疡，但皮肤有斑点或丘疹，用刀刮取皮肤，尽量收集皮肤渗液。同时收集梅毒患者的血液标本，包括全血、血浆、血清和单个核细胞。作者还收集拭子标本进行巢式PCR检测，敏感性为82%，特异性为95%；暗视野显微镜检查的敏感性为73%，特异性为88%。178例一期和二期梅毒患者，单个核细胞、血浆、血清和全血样本的敏感性为12%～38%，40例早期隐性梅毒患者的敏感性为4%～16%，一期、二期和早期隐性梅毒患者血标本总特异性为92%～97%。

Dumaresq等［22］应用实时荧光PCR检测122例HIV感染的早期梅毒患者的脑脊液，评价PCR在神经梅毒诊断中的价值。PCR检测的敏感性为58%，特异性为67%，PCR检测可辅助诊断神经梅毒。Castro等［16］发现，晚期隐性梅毒患者耳垂刮取液的Tp检出率最高，为56%，血浆、全血和血清分别为42.9%、38.1%和25%，作者认为耳垂血最适合做隐性梅毒患者PCR检测。目前文献显示，只有Castro采用耳垂血进行梅毒PCR检测，尚无其他学者进行耳垂血的PCR研究，耳垂血的优势还需要更多的实验来证实。

4 PCR的应用

4.1 一期梅毒：临床表现主要为硬下疳，因此一期梅毒患者主要取溃疡组织液标本进行PCR检测。Müller等［23］研究 4例一期梅毒的皮损组织病理标本，PCR全部阳性。 Shields等［24］检测55例一期梅毒患者的生殖器溃疡、直肠拭子和口腔溃疡标本，49例PCR阳性，敏感性为89.1%，特异性为99.1%。Gayet-Ageron等［14］研究26例一期梅毒患者，发现溃疡拭子阳性率为80%，全血为28%。目前认为，一期梅毒患者溃疡拭子PCR检测的敏感性高，适用PCR检测。尤其是血清学阴性的极早期梅毒患者，检测更有临床意义。

4.2 二期梅毒：临床表现主要是皮肤黏膜损害，包括斑疹、丘疹等，外阴及肛周的湿丘疹或扁平湿疣为其特征性损害。Müller等［23］研究34例二期梅毒皮损组织病理标本，发现26例PCR检测阳性（76%）。Shields等［24］收集22例二期梅毒患者梅毒疹拭子和黏膜皮损拭子，11例PCR阳性，敏感性为50%，特异性为100%。Gayet-Ageron等［14］研究40例二期梅毒患者，全血PCR阳性率为36%。以上研究提示，二期梅毒血液标本的阳性率<40%，PCR检测不适用于二期梅毒患者的诊断。

4.3 三期梅毒：可有一期或二期梅毒史，病程2年以上。Müller等［23］研究7例三期梅毒的皮损组织病理标本，1例PCR检测阳性（14%）。三期梅毒的PCR阳性率很低，不适用PCR检测。

4.4 神经梅毒：为Tp侵犯神经系统所致，采集脑脊液检测。Dumaresq等［22］研究发现，神经梅毒患者脑脊液PCR的敏感性为58%，特异性为67%。García等［25］检测了8例神经梅毒患者的脑脊液，敏感性为50%。Molepo等［26］采集50例怀疑神经梅毒患者的脑脊液，PCR检测28例阳性，阳性率为56%，脑脊液PCR检测阳性可辅助诊断神经梅毒。

4.5 胎传梅毒：我国梅毒诊疗指南指出，暗视野显微镜检查，或镀银染色在早期胎传梅毒皮肤、黏膜损害及组织标本中查到螺旋体，或Tp核酸检测阳性可确诊为胎传梅毒［4］。Michelow 等［27］研究 76 例未接受抗生素治疗的梅毒孕妇分娩的胎儿，17例脑脊液PCR检查螺旋体阳性，其中15例胎儿体检符合胎传梅毒的诊断。

综上所述，实时荧光PCR为梅毒PCR检测的主要方法，PCR扩增的靶基因主要有tpp47和polA。梅毒PCR检测主要适用于一期梅毒的溃疡拭子，其他各期梅毒标本检测阳性率较低，用于辅助诊断梅毒。

［1］Mabey D,Peeling RW.Syphilis,still a major cause of infant mortality［J］.Lancet Infect Dis，2011,11（9）:654-655.

［2］Tucker JD,Yin YP,Wang B,et al.An expanding syphilis epidemic in China:epidemiology,behavioural risk and control strategies with a focus on low-tier female sex workers and men who have sex with men［J］.Sex Transm Infect,2011,87（Suppl 2）:ii16-18.

［3］Janier M,Hegyi V,Dupin N,et al.2014 European guideline on the management of syphilis［J］.J Eur Acad Dermatol Venereol,2014,28（12）:1581-1593.

［4］中国疾病预防控制中心性病控制中心,中华医学会皮肤性病学分会性病学组,中国医师协会皮肤科医师分会性病亚专业学组.梅毒、淋病、生殖器疱疹、生殖道沙眼衣原体感染诊疗指南（2014）［J］.中华皮肤科杂志,2014,47（5）:365-367

［5］Morshed MG.Current trend on syphilis diagnosis:issues and challenges［J］.Adv Exp Med Biol,2014,808:51-64.

［6］Liu H,Rodes B,Chen CY,et al.New tests for syphilis:rational design of a PCR method for detection ofTreponema pallidumin clinical specimens using unique regions of the DNA polymerase I gene［J］.J Clin Microbiol,2001,39（5）:1941-1946.

［7］Centurion-Lara A,Castro C,Shaffer JM,et al.Detection of Treponema pallidumby a sensitive reverse transcriptase PCR［J］.J Clin Microbiol,1997,35（6）:1348-1352.

［8］Grange PA,Gressier L,Dion PL,et al.Evaluation of a PCR test for detection ofTreponema pallidumin swabs and blood ［J］.J Clin Microbiol,2012,50（3）:546-552.

［9］Scott LJ,Gunson RN,Carman WF,et al.A new multiplex realtime PCR test for HSV1/2 and syphilis:an evaluation of its impact in the laboratory and clinical setting ［J］.Sex Transm Infect,2010,86（7）:537-539.

［10］Heymans R,van der Helm JJ,de Vries HJ,et al.Clinical value ofTreponema pallidumreal-time PCR for diagnosis of syphilis［J］.J Clin Microbiol,2010,48（2）:497-502.

［11］Tipple C,Hanna MO,Hill S,et al.Getting the measure of syphilis:qPCR to better understand early infection ［J］.Sex Transm Infect,2011,87（6）:479-485.

［12］Cruz AR,Pillay A,Zuluaga AV,et al.Secondary syphilis in cali,Colombia:new concepts in disease pathogenesis［J/OL ］.PLoS Negl Trop Dis,2010,4 （5）:e690［2010-05-18］.http://journals.plos.org/plosntds/article?id=10.1371/journal.pntd.0000690.

［13］Bruisten SM.Protocols for detection and typing ofTreponema pallidumusing PCR methods［J］.Methods Mol Biol,2012,903:141-167.

［14］Gayet-Ageron A,Ninet B,Toutous-Trellu L,et al.Assessment of a real-time PCR test to diagnose syphilis from diverse biological samples［J］.Sex Transm Infect,2009,85（4）:264-269.

［15］雷震山,杜剑强,吴少琴,等.巢氏PCR在早期梅毒诊断中的应用评价［J］.现代生物医学进展,2013,13（23）:4529-4531.

［16］Castro R,Prieto E,Aguas MJ,et al.Detection ofTreponema pallidumsp pallidum DNA in latent syphilis ［J］.Int J STD AIDS,2007,18（12）:842-845.

［17］张森淼，陈访梅，蔡川川,等.两种PCR方法检测隐性梅毒患者TpDNA的初步比较［J］.皮肤性病诊疗学杂志,2014,21（1）:3-6

［18］Gayet-Ageron A,Lautenschlager S,Ninet B,et al.Sensitivity,specificity and likelihood ratios of PCR in the diagnosis of syphilis:a systematic review and meta-analysis ［J］.Sex Transm Infect,2013,89（3）:251-266.

［19］Chen CY,Chi KH,Pillay A,et al.Detection of the A2058G and A2059G 23S rRNA genepointmutationsassociated with azithromycin resistance inTreponema pallidum by use of a TaqMan real-time multiplex PCR assay ［J］.J Clin Microbiol,2013,51（3）:908-913.

［20］Peng RR,Wang AL,Li J,et al.Molecular typing ofTreponema pallidum:a systematic review and meta-analysis ［J/OL］.PLoS Negl Trop Dis,2011,5 （11）:e1273.［2011-11-08 ］.http://journals.plos.org/plosntds/article?id=10.1371/journal.pntd.0001273.

［21］Unemo M，Ballard,Ison C,et al.Laboratory diagnosis of sexually transmitted infections, including human immunodeficiency virus ［M］. Geneva: World Health Organization,2013:107-109.

［22］Dumaresq J,Langevin S,Gagnon S,et al.Clinical prediction and diagnosis of neurosyphilis in HIV-infected patients with early Syphilis［J］.J Clin Microbiol,2013,51（12）:4060-4066.

［23］Müller H,Eisendle K,Bruninger W,et al.Comparative analysis of immunohistochemistry,polymerase chain reaction and focusfloating microscopy for the detection ofTreponema pallidumin mucocutaneous lesions of primary,secondary and tertiary syphilis［J］.Br J Dermatol,2011,165（1）:50-60.

［24］Shields M,Guy RJ,Jeoffreys NJ,et al.A longitudinal evaluation ofTreponema pallidumPCR testing in early syphilis［J］.BMC Infect Dis,2012,12:353.

［25］García P,Grassi B,Fich F,et al.Laboratory diagnosis of Treponema palliduminfection in patients with early syphilis and neurosyphilis through a PCR-based test［J］.Rev Chilena Infectol,2011,28（4）:310-315.

［26］Molepo J,Pillay A,Weber B,et al.Molecular typing of Treponema pallidumstrains from patients with neurosyphilis in Pretoria,South Africa［J］.Sex Transm Infect,2007,83（3）:189-192.

［27］Michelow IC,Wendel GD Jr,Norgard MV,et al.Central nervous system infection in congenital syphilis［J］.N Engl J Med,2002,346（23）:1792-1798.

Detection ofTreponema pallidumwith PCR

Xue Yaohua*,Yang Bin,Zheng Heping.
*Department of Clinical Laboratory,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China

The diagnosis of syphilis is mainly based on clinical manifestations,serological analysis,and dark-field microscopy for detection ofTreponema pallidum.With further clarification of the genomic sequence ofTreponema pallidum,several PCR methods based onTreponema pallidum-specific gene sequences have been developed during the last 20 years.Classical PCR,nested-PCR,reverse transcription-PCR,multiplex PCR and real-time fluorescent PCR can be used to amplifyTreponema pallidumDNA in different types of clinical specimens,including lesion swabs,blood,cerebrospinal fluid,biopsy tissue,amniotic fluid,and so on.The target genes for PCR amplification include tpp47,polA,bmp,tmpA,arp and tpr,with tpp47 and polA as the most common target genes.

Syphilis;Treponema pallidum;Polymerase chain reaction;Gene amplification;Targeted gene

Zheng Heping,Email:zhhpf@hotmail.com

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2015.06.018

广东省科技厅计划项目（2011B031800225）

郑和平，Email:zhhpf@hotmail.com

2014-12-02）