裸花紫珠提取物凝血有效部位的研究

张利 黄胜 颜小捷 杨子明 谷陟欣 李典鹏

·论著·

裸花紫珠提取物凝血有效部位的研究

张利 黄胜 颜小捷 杨子明 谷陟欣 李典鹏

目的 研究裸花紫珠提取物凝血作用及其有效部位。方法 以质控血浆为研究对象,通过测定裸花紫珠粗提物及各分离部位和单体对凝血酶原时间(prothrombin time,PT)、凝血酶时间(thrombin time,TT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)、血浆纤维蛋白原(fibrinogen,FIB)四项指标观察其对凝血系统的影响。结果 与溶媒对照比较,裸花紫珠粗提物能明显缩短PT、APTT、TT的时间,能明显提高FIB含量;裸花紫珠40%甲醇洗脱部位能明显缩短APTT、TT的时间,能明显提高FIB含量;与粗提物比较,40%甲醇洗脱部位效果最接近于粗提物。结论 裸花紫珠有较好的凝血效果,其有效部位可能在40%甲醇洗脱部位。

裸花紫珠; 有效部位; 凝血; 凝血酶原时间

裸花紫珠Callicarpa nudiflora Hook.et Arn.为马鞭草科紫珠属植物,又名紫珠,主产于中国海南,是海南的一种道地药材,在广东、广西也有分布[1]。国外主要分布于越南、印度和马来西亚。其味苦、微辛,性平,根、茎、叶皆可入药,有解毒、抗菌消炎、收敛止血、散瘀消肿之功效,主治急性传染性肝炎、化脓性炎症、呼吸道及消化道出血、血小板减少性紫癜等症,外用主要用于治疗烧伤、烫伤、风湿肿痛、跌打肿痛、外伤出血、肺结核咳血、胃肠出血等症,是海南黎族医生常用药材之一[2-5]。目前对裸花紫珠凝血有效部位、凝血机制研究均较少,有学者报道裸花紫珠总黄酮是其凝血的主要有效成分[6]。为了探讨裸花紫珠凝血活性的有效部位及凝血机理,本实验对裸花紫珠凝血作用的主要活性部位进行了筛选研究,并初步探讨了其凝血作用机理。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂

裸花紫珠粗提干浸膏粉末(由九芝堂药业海南分公司提供);质控血浆(北京世帝,生产批号:20130508)、凝血酶原时间(prothrombin time,PT)试剂盒、凝血酶时间(thrombin time,TT)试剂盒、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)试剂盒、血浆纤维蛋白原(fibrinogen, FIB)凝血酶原时间(prothrombin time,PT)试剂盒、均为北京世帝科学仪器公司生产;甲醇(西陇化工,生产批号:121013)、二甲基亚砜(国药试剂,生产批号:110506)等试剂均为分析纯。

1.2 实验仪器

AT-200型电子天平(德国 METTLER公司), LG-PABER凝血因子分析仪(北京世帝),QD型高速离心机(珠海黑马),R-200型旋转蒸发仪(Buchi Labortechnik AG CH-9230),Agilent1100分析型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)。

1.3 有效部位和成分的提取分离

称取500 g裸花紫珠粗提干浸膏粉末,按质量体积为比为1∶20用适量去离子水完全溶解后先经布袋过滤,后经棉花塞过滤;所得滤液上HP-20大孔树脂,依次采用去离子水、5%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、80%甲醇洗脱,各梯度均洗脱至无颜色为止,得大孔树脂未吸附部分、水洗脱部位、5%甲醇洗脱部位、40%甲醇洗脱部位、60%甲醇洗脱部位、80%甲醇洗脱部位;将上述各部分分别于旋转蒸发仪50℃下减压浓缩得水洗脱部分浸膏、5%甲醇洗脱部分浸膏、40%甲醇洗脱部分浸膏、60%甲醇洗脱部分浸膏、80%甲醇洗脱部分浸膏。经HPLC分析,大孔树脂未吸附部位和5%甲醇洗脱部位均包含于水洗脱部位中,故将此三部分合并统称为水洗部位。其中水洗脱部位回收率为66.02%,40%甲醇洗脱部位回收率为19.22%,60%甲醇洗脱部位回收率为 8.50%,80%甲醇洗脱部位回收率为3.50%。从裸花紫珠粗提干浸膏粉末分离得到连翘酯苷B、原儿茶酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷4个单体,其中连翘酯苷B、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷主要从40%甲醇洗脱部分得到。

1.4 裸花紫珠提取物对凝血系统的影响

将水洗部位、40%甲醇洗脱部位、60%甲醇洗脱部位、80%甲醇洗脱部位4个活性部位;连翘酯苷B、原儿茶酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷4个单体化合物分别溶于20%的二甲基亚砜溶液中,以20%的DMSO溶液为空白对照组,取质控血浆量与试验药物溶液体积比为9∶1,混匀。每种药物重复实验3次,求其平均值。严格按LG-PABER半自动血小板聚集凝血因子分析仪操作规程,依次测定各试验药物PT、TT、APTT、FIB这4项血凝指标。血浆PT缩短率(%)=(溶媒对照平均PT-给药平均PT)/溶媒对照平均PT×100%;TT缩短率(%)=(溶媒对照平均TT-给药平均TT)/溶媒对照平均TT×100%; APTT缩短率(%)=(溶媒对照平均APTT-给药平均APTT)/溶媒对照平均APTT×100%;FIB提高率(%)=(给药平均FIB含量-溶媒对照平均FIB含量)/溶媒对照平均FIB含量×100%。

1.5 统计学处理

采用SPSS 11.5统计软件进行数据分析,实验数据均以(±s)表示,两个独立样本均数比较采用t检验,多个样本之间的比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD,P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 裸花紫珠提取物对PT的影响

与溶媒对照比较,粗提物组,水洗脱部位、80%甲醇洗脱部位2个部位,原儿茶酸、连翘酯苷B、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷4个单体的凝血酶原时间(PT)均明显缩短,有统计学意义;与粗提物(裸花紫珠粗提干浸膏粉末)比较,40%甲醇洗脱部位的PT明显延长,有统计学意义。结果见表1。

表1 裸花紫珠提取物对PT的影响(±s,n=3)

注:与溶媒对照比较,aP＜0.05,bP＜0.01;与粗提物比较,cP＜0.01。

组别 剂量(g/mL) PT(s) 缩短率(%)溶媒对照 — 16.6±0.6—2.4粗提物 0.050 15.8±0.7a4.8水洗脱部位 0.033 15.3±0.1b7.8 40%甲醇洗脱部位 0.010 16.8±0.4c-1.2 60%甲醇洗脱部位 0.004 16.5±0.2 0.6 80%甲醇洗脱部位 0.002 15.8±0.3a4.8原儿茶酸 0.002 15.8±0.1a4.8连翘酯苷B 0.002 15.8±0.2a4.8异毛蕊花糖苷 0.002 15.9±0.2a4.2毛蕊花糖苷 0.002 15.5±0.6b

2.2 裸花紫珠提取物对TT的影响

与溶媒对照比较,粗提物,水洗脱部位、40%甲醇洗脱部位、60%甲醇洗脱部位3个部位,连翘酯苷B、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷3个单体的凝血酶时间(TT)均明显缩短,有统计学意义;与粗提物比较, 4个活性部位及4个单体的TT明显延长,有统计学意义,其中40%甲醇洗脱部位最接近于粗提物。结果见表2。

表2 裸花紫珠提取物对TT的影响(±s,n=3)

注:与溶媒对照比较,aP＜0.01;与粗提物比较,bP＜0.01,cP＜0.05。

组别 剂量(g/mL) TT(s) 缩短率(%)溶媒对照 — 14.1±0.2—5.0粗提物 0.050 11.8±0.3a16.3水洗脱部位 0.033 13.4±0.5ac5.0 40%甲醇洗脱部位 0.010 12.3±0.1ab12.8 60%甲醇洗脱部位 0.004 13.3±0.3ac5.7 80%甲醇洗脱部位 0.002 13.8±0.2c2.1原儿茶酸 0.002 13.9±0.1c1.4连翘酯苷B 0.002 13.3±0.3ac5.7异毛蕊花糖苷 0.002 13.2±0.4ac6.4毛蕊花糖苷 0.002 13.4±0.1ac

2.3 裸花紫珠提取物对APTT的影响

与溶媒对照比较,粗提物活化部分凝血活酶时间(APTT)明显缩短,有统计学意义,水洗脱部位APTT明显延长,有统计学意义;与粗提物比较,水洗脱部位、40%甲醇洗脱部位、80%甲醇洗脱部位3个部位,原儿茶酸、连翘酯苷B、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷4个单体APTT明显延长,有统计学意义,其中40%甲醇洗脱部位、60%甲醇洗脱部位最接近于粗提物。结果见表3。

表3 裸花紫珠提取物对APTT的影响(±s,n=3)

注:与溶媒对照比较,aP＜0.01;与粗提物比较,bP＜0.05,cP＜0.01。

组别 剂量(g/mL)APPT(s) 缩短率(%)溶媒对照 — 39.4±1.6—-0.3粗提物 0.050 37.2±0.5a5.6水洗脱部位 0.033 45.0±0.8ac-14.2 40%甲醇洗脱部位 0.010 38.8±0.6b1.5 60%甲醇洗脱部位 0.004 38.0±0.8 3.6 80%甲醇洗脱部位 0.002 38.8±0.7b1.5原儿茶酸 0.002 40.6±0.3c-3.0连翘酯苷B 0.002 40.2±0.4c-2.0异毛蕊花糖苷 0.002 40.6±0.6c-3.0毛蕊花糖苷 0.002 39.5±1.5c

2.4 裸花紫珠提取物对FIB的影响

与溶媒对照比较,粗提物,40%甲醇洗脱部位1个部位,连翘酯苷B、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷3个单体的纤维蛋白原(FIB)均明显延长,有统计学意义;与粗提物比较,60%甲醇洗脱部位、原儿茶酸明显缩短,有统计学意义;其中40%甲醇洗脱部位优于于粗提物。结果见表4。

表4 裸花紫珠提取物对FIB的影响(±s,n=3)

注:与溶媒对照比较,aP＜0.05,bP＜0.01;与粗提物比较,cP＜0.05。

组别 剂量(g/mL) FIB(g/L) 提高率(%)溶媒对照 — 3.76±0.30—21.3粗提物 0.050 4.73±0.18b25.8水洗脱部位 0.033 4.23±0.13 12.5 40%甲醇洗脱部位 0.010 4.89±0.31b30.1 60%甲醇洗脱部位 0.004 4.18±0.20c11.2 80%甲醇洗脱部位 0.002 4.25±0.04 13.0原儿茶酸 0.002 4.14±0.12c10.1连翘酯苷B 0.002 4.41±0.36a17.3异毛蕊花糖苷 0.002 4.40±0.67a17.0毛蕊花糖苷 0.002 4.56±0.13b

3 讨论

目前市场上由裸花紫珠提取制成的制剂有裸花紫珠胶囊、裸花紫珠颗粒、裸花紫珠片、灭滴消炎栓与复方木麻黄片等[7-8],这些制剂的药用原料仅限于裸花紫珠浸膏或其水粗提物,颜色深,成分杂,对裸花紫珠凝血活性部位及其化学成分未有明确研究,也就是说迄今为止,尚不清楚裸花紫珠凝血作用的化学物质基础,阻碍了裸花紫珠药用产品的研制。凝血酶原时PT能准确、有效地反映外源性凝血系统,TT能有效地反映内源性凝血系统,APTT反映内、外源共同性凝血系统,FIB是通过对纤溶系统的影响反映凝血效果[9-10]。本实验通过测定其PT、TT、APTT、FIB四项指标观察裸花紫珠对凝血系统的影响,结果发现裸花紫珠4个分离部位中,以40%甲醇洗脱部位凝血效果最好,最接近于裸花紫珠粗提物,说明裸花紫珠凝血有效部位可能在40%甲醇洗脱部位。毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、连翘酯苷B,这3个单体都有较好的凝血效果,而它们又主要在40%甲醇洗脱部位,进一步确证裸花紫珠凝血有效部位可能在40%醇洗脱部位,具体确切的有效成分和作用机理还需深入研究。

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Effects of active fraction from Callicarpa nudiflora on blood coagulation system

ZHANG Li,HUANGSheng,YAN Xiao-jie,et al. Guangxi Key Laboratory of Functional Phytochemicals Research and Utilization,Guangxi Institute of Botany,Chinese Academy of Sciences,Guilin 541006,China

LIDian-peng,E-mail:ldp@gxib.cn

Objective To study the effect of active fraction from Callicarpa nudiflora on blood coagulation system.M ethods The effect of active fraction from Callicarpa nudiflora on blood coagulation system were observed with prothrombin time(PT),activated partial thromboplastin time(APTT),thrombin time(TT)and fibrinogen(FIB)of the constituents blood sampleswere tested.Results Compared with the blank control,Callicarpa nudiflora extract could significantly lessen PT,TT,APTT,and could obviously increased the content of FIB;40%Methanol elution par could significantly lessen TT,APTT,and could obviously increased the content of FIB.Conclusion The hemostatic effect of active fraction from Callicarpa nudiflora may be 40%Methanol elution par of Callicarpa nudiflora.

Callicarpa nudiflora; Hemostatic; Mice; Prothrombin time

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.11.021

2015-06-15)

(本文编辑:董历华)

国家科技支撑计划(SQ2010BAJY1411-07-05);海南省中药现代化专项(2012ZY020);广西植物研究所与九芝堂股份有限公司横向合作项目;广西植物功能物质研究与利用重点实验室主任基金项目(ZRJJ2014-7)

541006桂林,广西植物功能物质研究与利用重点实验室广西植物研究所(张利、颜小捷、杨子明、李典鹏);九芝堂股份有限公司(黄胜、谷陟欣);海南九芝堂药业有限公司(黄胜)

张利(1983-),本科,助理实验师。研究方向:植物活性物开发与利用研究。E-mail:345576619@qq.com

李典鹏(1968-),博士,研究员。研究方向:植物活性物开发与利用研究。E-mail:ldp@gxib.cn