基于DNA条形码—产地—形态分析联用的巴西草药DENTEDE LEÃO(蒲公英)的混伪品鉴定及生药学研究

顾选 崔秀梅 余春霞 马长华 肖瑶 韩丽 刘春生 赵百孝 哈略

·巴西草药研究专题·

基于DNA条形码—产地—形态分析联用的巴西草药DENTEDE LEÃO(蒲公英)的混伪品鉴定及生药学研究

顾选 崔秀梅 余春霞 马长华 肖瑶 韩丽 刘春生 赵百孝 哈略

目的 对巴西市场上销售的药用蒲公英的混伪品进行鉴定及生药学研究。方法 通过提取样品DNA、PCR扩增及双向测序,获得样品的ITS序列。采用相似度分析法进行分子鉴定;根据植物产地分布特征和形态特征验证结果,三种方法联用获得鉴定结果;分析混伪品的性状和显微特征。结果 DNA条形码研究表明巴西药用蒲公英的混伪品来源于菊科植物假蒲公英猫儿菊Hypochaeris radicata的全草,产地分析和形态分析验证了DNA条形码鉴定结果。结论 巴西药用蒲公英的混伪品来源于菊科蒲公英属植物假蒲公英猫儿菊Hypochaeris radicata的全草。混伪品的生药学特征能够为巴西草药DENTE DE LEÃO的真伪鉴别提供依据。

巴西草药; 药用蒲公英; 混伪品; DNA条形码; 鉴定

草药DENTE DE LEÃO是巴西民族的常用药,常作为助消化与利水通淋类药物[1]。笔者在走访巴西药材市场时发现,DENTE DE LEÃO被人们当做药用蒲公英Taraxacum officinale出售及使用,有研究亦认为DENTE DE LEÃO的来源为药用蒲公英。但是笔者发现,市场上收集的草药DENTE DE LEÃO与药用蒲公英植物的性状描述有差异。为保证巴西药用蒲公英临床使用的准确性和安全性,有必要对巴西药用蒲公英的混伪品进行品种鉴定研究,为其质量控制提供依据。

性状鉴定方法具有简单、经济的优点,但其依赖于鉴定者的经验和文献资料,主观性较强[2],显微特征往往难以解决属以下近缘种药材的鉴定难题[3]。随着分子生物技术的迅速发展,DNA条形码技术凭借高效、准确、客观、能够鉴别无背景信息的样品的优点[4-5],广泛应用于中药鉴定[6-8]。但是,对于原始部落的民族药用植物,同属物种亲缘关系密切,条形码相似度极高,还存在数据库注册物种序列不全面的问题,DNA条形码鉴定方法不能完全解决民族药鉴定的问题。药用植物通常具有其固定的产地,尤其是野生药用植物,产地信息对药材鉴定有重要作用。植物的部分信息,如叶片形态、花蕾、果实信息等,在科属确定的基础上,对种的鉴别具有重要意义[9]。基于以上思路,本研究采用“DNA条形码-产地-形态”联用方法对药材混伪品进行鉴定,该方法能够弥补传统鉴定方法的缺点,为药材鉴别和质量控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

2012年4月于巴西隆城市场采购巴西药用蒲公英伪品3批,每批200 g,样品的凭证标本保存于北京中医药大学标本室。

1.2 试剂

广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒(北京博迈德生物有限公司,批号:69632855)、Taq酶等PCR试剂(上海生工生物工程有限公司,批号: 695673BE)、乙醇、琼脂糖、ddH2O等。

1.3 仪器

SIGMA3K-15低温高速离心机(SIGMA公司), TECHNE TC-3000PCR扩增仪,Bio-Rad电泳仪,水平电泳槽(北京六一仪器厂),JS-680B全自动凝胶成像分析仪(上海培清科技有限公司),GRANT制冰机,超纯水制备系统,KQ5200E型超声波清洗器, SANYO-80℃超低温冰箱(SANYO公司),DHG-9145A型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)。

1.4 DNA提取和PCR扩增

方法取样品,观察形态,形态结果一致。取叶片进行DNA提取。各份样本分别用液氮冷冻后研磨成细粉,采用植物DNA提取试剂盒提取总DNA。采用ITS序列通用引物在热循环扩增仪上进行扩增,PCR扩增条件:50μL体系含 2×Taq PCR MasterMix 25μL,引物 P1和 P4各加2.5μL(5 μmol/L),DNA模板4μL,ddH2O 16μL。PCR扩增程序:94℃预变性5分钟,94℃变性1分钟,55℃退火1分钟,72℃延伸1分钟,40个循环后,72℃延伸10分钟[3]。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下检视,均由上海生工生物工程有限公司测序部测序。各样品均采用正向和反向测序,以保证测序的准确性。

1.5 序列分析方法

利用ContigExpress软件对测序获得的正、反向序列进行拼接,根据ITS序列边界保守区截取待鉴定物种的ITS全长序列,然后利用相似度法分析序列。

1.6 基于DNA条形码的鉴定方法

根据NCBI中BLAST功能,检索NCBI中注册的相似度最高的物种,按照相似度最高的物种截取ITS全长。再利用样品的ITS序列检索,本文以相似度90%[11-12]为科属的鉴定阈值,以最高相似度科属为鉴定依据;以相似度97%为物种鉴定阈值,认为相似度在97%以上可能为相同物种,否则,数据库中可能未收录该序列,以相似度97%以上的最高相似度物种为鉴定依据,获得鉴定结果。

1.7 基于产地分析的鉴定方法

根据“1.6”项下获得的物种鉴定结果,依据《巴西植物志》记载该属植物物种信息,如果最高相似度物种与产地分析不符合,分析第二最高相似度物种,直到符合产地分析要求,获得物种的鉴定结果。

1.8 基于形态分析的鉴定方法

根据“1.7”项下获得的鉴定结果,查询《巴西植物志》数据库中巴西草药的形态信息,通过形态核对,进一步证实“1.7”项下的鉴定结果。

1.9 生药学研究及比较

根据颜色、形状、大小等观察混伪品的性状特征,在显微镜下观察显微特征,描述混伪品的性状和显微特征,比较混伪品和药用蒲公英的区别。

2 结果与分析

2.1 基于DNA条形码的鉴定

2.1.1 科属的鉴定3份样品的测序峰图良好,3份样品的测序结果一致,选择一条序列用于后续分析。截取ITS片段后,经BLAST检索,样品与菊科猫儿菊属Hypochaeris L.植物相似度最高,相似度范围为91%～100%,与其他属相似度均低于91%。因此,该样品来自菊科猫儿菊属植物。

2.1.2 种的鉴定 根据DNA条形码鉴定指标(相同物种相似度达到97%以上,相似度最高的物种为最佳鉴定结果),样品与假蒲公英猫儿菊Hypochaeris radicata的相似度最高,相似度为100%,因此,巴西药用蒲公英伪品的基原为假蒲公英猫儿菊。

2.2 基于产地分析的鉴定

根据文献记载,南美洲国家很早引进假蒲公英猫儿菊物种,巴西20世纪已有假蒲公英猫儿菊物种的记载。因此,从产地信息分析,该巴西草药可能为Hypochaeris radicata。

2.3 基于形态分析的鉴定

样品具有主根。叶倒披针形,基部狭窄,边缘波状齿,先端圆形。花具有少数几个头状花序,小花呈明亮的黄色。瘦果棕色,体圆筒状,具有冠毛。与药用蒲公英的主要区别是:药用蒲公英叶片形状具有明显羽状深裂,顶端裂片三角形[13];而假蒲公英猫儿菊叶片披针形,边缘波状齿,先端圆形。根据以上特征,本品与www.efloras.org数据库中收载的假蒲公英猫儿菊的形态特征基本符合,因此,根据形态分析,本品来源于菊科假蒲公英猫儿菊的全草。

2.4 混伪品的生药学研究

2.4.1 性状特征 混伪品根头部倒圆锥形,基生,花梗一至数个。叶多皱缩破碎,灰绿色或绿褐色,富黄白色柔毛,先端钝或尖,叶基部渐狭,下延成柄状,浅裂。花倒圆锥形,有时稍压扁呈扇形。头状花序,总苞片多层,外层为舌状花,管状花多数,位于中央,黄色。花梗较长,灰绿色,中空,光滑,直径0.2～0.7 cm,折断面纤维性,外层灰绿色,内层黄白色,内层质松软,有弹性。果椭圆形,具白色冠状毛,由花托处发射状长出瘦果。混伪品与药用蒲公英在叶片形状上存在较大的区别:药用蒲公英叶片形状具有明显羽状深裂,顶端裂片三角形;而假蒲公英猫儿菊叶片披针形,边缘波状齿,先端圆形。

2.4.2 显微特征 粉末棕黄色。(1)导管常见具缘纹孔导管,少见螺纹导管或双螺纹导管。(2)花粉粒类球形,外壁有刺。(3)菊糖结晶,不规则形。(4)石细胞淡黄棕色,类方形,类长方形,类圆形或不规则形,有的层纹明显,壁较厚。

3 讨论

传统的鉴定方法依靠文献和鉴定人员的经验,不能鉴别无背景信息的药材,DNA条形码技术能够弥补传统鉴定方法的不足,通过分子鉴定技术能够对无背景信息药材鉴定,不受样品开花季节及样品外形的影响。有时相似度最高的序列有多个物种,这时利用分子鉴定技术进行药材鉴定也存在困难;采用产地分析和形态分析能够较好的验证DNA条形码鉴定方法的鉴定结果,得到准确的鉴定结果。采用DNA条形码-产地-形态联合分析,能够快速、准确地对未知样品进行鉴定。通过生药学研究发现,性状特征能够为巴西草药的质量控制提供依据。

假蒲公英猫儿菊原产于非洲北部和欧洲,而后,非洲南部和亚洲东南部、澳洲印度北部、日本、北美、南美以及太平洋群岛引进该物种。在1974年中国发现该物种,最早见于《台湾植物志》。由于花色鲜艳,可用于盆栽或切花[14]。假蒲公英猫儿菊与药用蒲公英在形态特征上较为相似,易导致经验不足的人误采误收,给临床上的准确用药带来潜在的威胁。因此,采药和用药人员应注意观察药用蒲公英的叶片特征来鉴别物种,保证准确用药。

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The pharmacognosy research on the adulterants of Brazilian herb DENTE DE LEÃO based on a combined analysis of DNA barcoding-origin-morphology

GU Xuan,CUIXiu-mei,YU Chun-xia,etal. School ofChinese Materia Medica,Beijing University ofChinese Medicine,Beijing 100102,China Corresponding author:LIU Chun-sheng,E-mail:max_liucs@263.net

Objective To study a new adulterant of DENTE DE LEÃO in Brazil and perform a pharmaceutical analysi.M ethods Total genomic DNA was isolated from thematerials,,and nuclear DNA ITS sequences were amplified and sequenced.Similarity identification of BLAST analysis was performed. Next,the results were verified according to plant geographical distribution and morphological profiles. Finally,the features of adulterant were demonstrated through microscopic observation.Results

Adulterants of Brazil herbs DENTE DE LEÃO was Hypochaeris radicata Linnaeus,Sp.Pl.The origin analysis and morphological analysis verified the results of DNA barcoding.Conclusion Adulterants of Brazilian herb DENTE DE LEÃO are from the Asteraceae plant Hypochaeris radicata with the whole plants. Adulterants pharmacognosy features can provide the basis for identification of Brazil herbs DENTE DE LEÃO.

Brazilian herb; DENTE DE LEÃO; Adulterants; DNA barcoding; Identification

R284

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.11.004

2015-08-22)

(本文编辑:董历华)

国家国际科技合作专项(2011DFA31370)

100102 北京中医药大学中药学院(刘春生、马长华),针灸推拿学院[赵百孝、哈略(硕士研究生)],中医养生学研究所(韩丽);北京华邈中药工程技术开发中心(顾选、崔秀梅);河南省药品审评认证中心(余春霞)

顾选(1990-),女,硕士。研究方向:药用植物与分子生药学。E-mail:guxuan123.love@163.com

刘春生(1964-),博士,教授,博士生导师。研究方向:药用植物与分子生药学。E-mail:max_liucs@263.net