膈下逐瘀汤加减方作用人肝癌细胞SMMC-7721 蛋白质组学研究*

李华成 王建刚 费新应△ 汪建平

1.黄石市中医医院(传染病医院)肝病科 (湖北 黄石，435100) 2.湖北中医药大学(湖北 武汉，430065) 3.华中科技大学同济医学院药学院 (湖北 武汉，430030)

原发性肝癌(简称肝癌)是一种恶性程度高、进展快、预后差的恶性肿瘤，其全球发病率和死亡率分别列所有肿瘤的第7位和第4 位［1］。我国是乙型肝炎高发区，肝癌发病率占全球总数的55%，近80%患者确诊时已属中晚期，5年以上长期生存率仅为10%左右［2］。我们运用膈下逐瘀汤加减方(以下简称GXZY)治疗肝癌，发现能够提高患者的生存率，可以改善患者生活质量，且没有明显的毒副作用［3］。前期实验研究显示膈下逐瘀汤加减方对肝癌H22荷瘤小鼠有明显抑制作用［4］，并可以抑制人肝癌细胞SMMC-7721 的增殖，诱导SMMC-7721 细胞凋亡，抑制SMMC-7721 细胞端粒酶活性，调控癌基因活化与抑癌基因失活，阻止肿瘤细胞的无限繁殖［5，6］。本研究从蛋白质组学的水平探讨膈下逐瘀汤加减方对肝癌的作用机制，寻找其药效作用的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与细胞 健康SD 大鼠20 只，SPF 级，雌雄各半，体质量(250 ±20.9)g，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心，实验动物质量合格证编号:No.42009800000170-42009800 000172;人肝癌细胞株SMMC-7721 购自中国科学院细胞库。

1.1.2 实验用药 GXZY 由五灵脂、桃仁、赤芍、红花各6g，当归、川芎、丹皮、玄胡、甘草各10g，龙葵、茯苓各20g，蜈蚣3g，薏苡仁30g 组成。GXZY 汤制备及提取流程:加水煎煮，浓缩得药液，浓度为3g/ml，置冰箱中备用。

1.1.3 主要试剂及仪器 固相pH 梯度IPG 干胶条(pH 4～7，24 cm Bio-Rad 公司，美国);除白蛋白和球蛋白试剂盒(Merck，美国公司);蛋白沉淀试剂盒(Merck，美国公司);HRP 标记的山羊抗兔IgG(KPL 公司);ABC 免疫组化试剂盒、DAB 显色试剂盒(武汉博士德公司);ECL 化学发光系统(碧云天生物技术研究所);Cocktail 蛋白酶抑制剂(Roche 公司);ReverTra Ace 定量PCR 试剂盒(TOYOBO 公司，日本);Trizol Reagent RNA 提取试剂盒、PCR 引物(Invitrogen 公司，美国);IPGphor 等电聚焦仪、垂直电泳槽(GE Healthcare 公司，美国);JY96-Ⅱ超声仪(宁波新芝公司);超净工作台(苏州苏净安泰);Ultraflex ⅢTOF/TOF 质谱仪(Bruker Dalton，德国);UMAX Powerlook 1100 扫描仪(力捷，台湾);ImageMaster 2D platinum 5.0 图像分析软件(GE 公司，美国)

1.2 方法

1.2.1 动物模型及药物血清制备 将20 只SD 大鼠随机分为空白对照组、GXZY 血清组(各10 只)。空白对照大鼠每日灌胃生理盐水5ml/只，GXZY 组大鼠每日灌胃10ml/kg GXZY 药液，均连续灌胃3d。于第3d 最后一次灌胃后1h(灌胃前12h 禁食)股动脉采血，3 000rpm，20min 离心，合并同组动物血清，用0.221μm微孔滤膜过滤除菌，于56℃、30min 水浴灭活，并用完全培养液配成10%的GXZY 血清培养液以及无药血清培养液，4℃保存，两周内使用。

1.2.2 细胞培养条件与处理 人肝癌细胞株SMMC-7721 接种于含10%小牛血清、100U/ml 青霉素和100μg/ml 链霉素的RPMI-1640 完全培养液中，在37℃、含5%CO2培养箱内培养，并用0.25%胰蛋白酶消化传代，接种于6 孔培养板，每孔5×105个细胞，每组均设为6个平行孔。培养24h 至细胞生长旺盛后，去培养液，随机分为两组，GXZY 血清组(加入GXZY 含药血清培养液)、空白对照组(加入无药血清培养液)，继续培养48h 后结束。

1.2.3 细胞蛋白质样品制备 按除白蛋白和球蛋白试剂盒的说明书进行高丰度蛋白去除，预处理后的样品采用Bradford 蛋白定量方法进行蛋白定量。

1.2.4 双向凝胶电泳(2-DE)和图像分析 按Bio-Rad 公司双向凝胶电泳手册进行。第一向固相pH 梯度等电聚焦，胶条经两步平衡后转移至12.5%的均匀胶上进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，运用ImageMaster 2D platinum 5.0 图像分析软件进行电泳图分析。

1.2.5 MALDI-TOF-MS 质谱分析 将差异表达的蛋白质点从胶上切下，经脱色、真空离心干燥、Trypsin 酶切萃取两次，将萃取液冷冻真空抽干后以3μl 50% ACN/0.5% TFA 水溶液复溶，加入过饱和基质溶液3 μl，混匀后取2 μl 点样于不锈钢靶板上，空气自然干燥后备用。利用Bruker Dalton Ultraflex III TOF/TOF 质谱仪进行质谱分析。UV 波长为355nm，重复速率为200HZ，加速电压为20000V，最优质量分辨率为1500Da。扫描质量范围为700～3200Da，收集信号。胰酶自切峰为内标校正质谱仪。所有实验样品的质谱图均以默认模式获得。利用软件Bruker Dalton flexAnalysis 过滤基线峰、识别信号峰，Bruker Dalton BioTools 软件搜索NCBI 数据库，寻找匹配的相关蛋白质，同时查询其功能，来明确鉴定的蛋白质为何种蛋白质。

2 结果

2.1 2-DE 图谱结果分析 GXZY 含药血清组和空白对照组2-DE 图谱经过ImageMaster 2D platinum 5.0 软件分析，获得两组间差异表达的蛋白质点66个，其中GXZY 血清组的蛋白电泳图谱上有33个蛋白质点高表达，空白对照组的蛋白电泳图谱上有33个蛋白质点高表达。其中部分差异表达明显的蛋白质点2-DE 放大图谱结果见图1。

图1 部分差异表达蛋白质点2-DE 图谱放大结果(图1 中1～6 处的蛋白质名称见表1)

表1 差异蛋白质点的质谱鉴定结果

2.2 差异表达蛋白质点的质谱鉴定 根据图像分析，选取10个差异表达显著的蛋白质点经胶内酶解后进行MALDI-TOF-MS分析，获得肽质量指纹图谱，利用BioTools 软件搜索NCBI 数据库，结果显示有6个蛋白质点得到鉴定，其中与空白对照组比较，GXZY 血清组有5个蛋白质点表达下调，1个蛋白质点表达上调。差异表达蛋白质点质谱鉴定结果见表1。

3 讨论

中药复方具有多靶点、多途径、多层次作用的特点，传统研究方法不能从整体水平研究中药复方的治疗机制。蛋白质组学的诞生与发展，可以在整体水平上发掘肝癌发病机制、早期诊断、预后判断的蛋白标志物，并寻求潜在药物作用靶点，在肝癌临床诊断和治疗方面有十分诱人的前景［7］。随着高分辨率的2-DE 分离及质谱分析等蛋白质研究技术的发展，蛋白质组学的差异蛋白质组分析成为筛选中药作用靶点的一种有效手段，已大量应用于中药新药研究［8］。

PGAM1 即磷酸甘油酸变位酶1，是糖酵解过程重要的酶之一，主要催化3-磷酸甘油酸生成2-磷酸甘油酸的过程。肿瘤细胞内糖酵解过程较正常细胞活跃，在这过程中涉及的多种酶常表达异常。Ren F［9］等对肝细胞癌组织及肝正常组织研究发现，PGAM1 在66.7%的肝细胞癌组织中被发现显著上调。本研究结果发现，空白对照组细胞中PGAM1 表达显著上调，而经GXZY 药物血清处理的细胞表达下调，提示GXZY 可能抑制肝癌细胞能量代谢过程，阻止癌细胞生长。

STMN1，也称癌蛋白18，是一种普遍存在，高度保守，分子量为19kD 的胞质磷蛋白。多种恶性肿瘤中STMN1 都有高水平表达。甘淋等［10］研究发现stathmin 的表达下调可抑制肝癌细胞HCCLM3 的增殖，诱导其凋亡，以及抑制其黏附、运动和侵袭。本研究发现，GXZY 血清组细胞STMN1 表达下调，提示该蛋白可能为GXZY 的作用靶点。

Tropomyosin(TPM)，即原肌球蛋白，是肌肉收缩过程中重要的调节蛋白质，在骨骼肌和平滑肌细肌丝中，与肌动蛋白双螺旋并行存在，可影响并调控肌动球蛋白之间的相互作用［11］。TPM 在调节细胞能动性，细胞移动和诱导内皮细胞凋亡等方面起着重要作用，参与肿瘤生长和转移过程［12］。原肌球蛋白4(TPM4)是已经确认的4 种基因(TPM1，TPM2，TPM3 和TPM4)编码的蛋白质家族中的一个［13］。众多恶性肿瘤包括卵巢癌、前列腺癌、口腔立方上皮癌等，以及非小细胞肺癌、结肠癌，TPM均表达下降［14］。本研究结果中，GXZY 血清组细胞TPM4 呈表达上调，提示该蛋白可能为GXZY 的作用靶点。

热休克蛋白90(HSP90)是维持细胞内蛋白构象稳定与功能正常所必需的分子伴侣，有HSPα、HSPβ 两种亚型。许多信号转导蛋白的正常功能发挥都依赖于HSP90。正常细胞中HSP90 是受细胞周期调控的，但在肿瘤细胞中，HSP90 呈现持续的高诱导表达，在调节肿瘤细胞周期、增殖、分化等方面有着重要作用，成为抗癌药物作用的靶点［15，16］。本研究结果中GXZY血清组细胞HSP90β 呈表达下调，提示该蛋白可能为GXZY 的作用靶点。

突触囊泡膜蛋白同源蛋白(VAT1)在胚胎发育中依次在三叉神经簇、后脑、神经管和松果体中表达，在受精后24h 可在发育肠管中检测到。在发育最后阶段在神经管中的表达缺失，而仍可在大脑、视网膜和咽腔中检测到。腺苷高半胱氨酸水解酶(AHCY)是已知唯一的催化腺苷高半胱氨酸(SAH)分解为同型半胱氨酸(高半胱氨酸，Hey)和腺苷的酶。具有调节细胞内甲基循环代谢的重要作用，其酶的活性功能与细胞中磷脂、蛋白质、DNA、RNA 和其他小分子的甲基化作用密切相关，一旦酶活性下降或者被抑制，细胞本身的磷脂、蛋白质和核酸等的代谢就会受到影响，进而影响细胞生命的正常代谢［17］。陈宁［18］曾研究发现VAT-1 在高转移肝癌细胞中表达上调。这两种蛋白质目前国内研究报道较少，本研究结果显示他们在空白对照组细胞中表达上调，而在GXZY 药物血清组表达下调，提示它们可能是肝癌新的标记蛋白及GXZY 的作用靶点。

［1］高姗，杨万水，高静，等.原发性肝癌的分子流行病学研究进展［J］.中国肿瘤，2012，21(2):136 -144.

［2］张爱英，刘秀红，张永宏，等.肝癌血清标志物研究进展［J］.现代生物医学进展，2014，14(25):1981 -1983.

［3］费新应，黄廷荣，沈震，等.膈下逐瘀汤辅助治疗原发性肝癌的临床观察［J］.湖北中医杂志，2006，28(1):34.

［4］黄廷荣，费新应，余珊珊，等.膈下逐瘀汤加减方对肝癌H22 荷瘤小鼠的作用［J］.中国中西医结合杂志，2007，15(5):326 -328.

［5］费新应，黄廷荣，李世林，等.膈下逐瘀汤加减方对人肝癌细胞端粒酶的影响［J］.中西医结合肝病杂志，2008，18(5):292 -293.

［6］黄廷荣，周虹，费新应，等.膈下逐瘀汤加减方对人肝癌细胞bax、bcl-2、P53基因表达调控的影响［J］.中西医结合肝病杂志，2008，18(6):355 -356，366.

［7］王建钢，费新应，宋青.蛋白质组学研究技术在肝细胞癌诊疗中的应用［J］.临床肝胆病杂志，30(9):958 -960.

［8］郭宏.基于蛋白质作用靶点筛选的中药新药研究评析［J］.中华中医药杂志，2011，26(3):423 -426.

［9］Ren F，Wu H，Lei Y，et al.Quantitative proteomics identification of phosphoglycerate mutase 1 as a novel therapeutic target in hepatocellular carcinoma［J］.Mol Cancer，2010，19(9):81.

［10］甘淋，李娟，郭坤，等.Stathmin 对肝癌细胞HCCLM3 增殖及其肿瘤相关基因表达的影响［J］.中华肝脏病杂志，2011，19(8):571-576.

［11］杨静娴.原肌球蛋白的分子生物学研究进展［J］.大连医科大学学报，2004，26(2):145 -147.

［12］李明娜，张炜明，曹海龙，等.原肌球蛋白1 在非小细胞肺癌中的表达及意义［J］.江苏医药，2010，36(18):2133 -2136.

［13］张轶，刘文韬，李强，等.肿瘤转移相关基因原肌球蛋白的克隆及功能初步研究［J］.中华肿瘤杂志，2007，29(9):644 -648.

［14］Raval GN，Bharadwaj S，Levine EA，et al.Loss of expression of tropomyosin-1，a novel class II tumor suppressor that induces anoikis，in primary breast tumors［J］.Oncogene，2003，22(40):6194 -6203.

［15］胡秀娟.HSP90 在肿瘤中的研究［J］.医学综述，2008，14(1):67-69.

［16］赵鑫.肿瘤治疗分子靶点HSP90 研究进展［J］.国外医学·肿瘤学分册，2004，31(8):594 -596.

［17］陈宁.高、低转移肝细胞癌细胞株的定量蛋白质组研究［D］.北京:军事医学科学院，2008.

［18］周宁.酒精性肝病发生发展的基因组学和蛋白质组学研究［D］.杭州:浙江大学，2013:78.