慢速程序化冷冻人类扩张期囊胚的效果观察

柳朝华，高士友，邓朝晖，李 昀

（湖南省妇幼保健院生殖中心，湖南 长沙 410008）

慢速程序化冷冻人类扩张期囊胚的效果观察

柳朝华，高士友，邓朝晖，李 昀

（湖南省妇幼保健院生殖中心，湖南 长沙 410008）

目的 探讨慢速程序化冷冻在人类扩张期囊胚冷冻中的应用效果。方法收集2014年1～4月在本中心进行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)或卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)治疗的579个周期患者移植及冷冻后剩余的低质量胚胎(包括异常受精胚胎)发育成的扩张期囊胚87枚，用显微注射针刺穿囊胚腔使之皱缩，然后行程序化冷冻(囊胚组)。对照组为同期行程序化冻融的卵裂期胚胎。比较两组经冷冻复苏后的胚胎存活率。结果扩张期囊胚复苏率为80.46%，卵裂期胚胎复苏率为82.80%，两组比较差异无统计学意义(χ2=1.105，P＞0.05)。结论扩张期囊胚经人工皱缩后行程序化冷冻行之有效，能明显提高囊胚的冷冻效率。

扩张期囊胚；人工皱缩；慢速程序化冷冻

随着囊胚移植的发展，囊胚的冷冻保存显得日益重要，改进和完善囊胚的冷冻保存方法成为当前辅助生殖领域研究的热点之一。普通的程序化冷冻人类囊胚虽已获得妊娠及足月分娩，但易出现冷冻损伤，使得复苏率和妊娠率不稳定[1]。较多研究表明人工皱缩囊胚腔能有效提高囊胚玻璃化冷冻的效果[2-3]。而随着玻璃化冷冻技术的飞速发展，国内外一部分生殖中心已经放弃了慢速程序化冷冻。人类胚胎冷冻真的已经到了玻璃化冷冻的时代了吗？

本研究应用慢速程序化冷冻法冻融人工皱缩后扩张期囊胚及卵裂期胚胎，分别比较两组胚胎复苏后的存活情况，观察慢速冷冻对扩张期囊胚的冻存效果，为临床应用奠定基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年1～4月在本生殖中心行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)或卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)治疗的579个周期资料。患者年龄22～43岁，平均(31.9±4.2)岁。不孕原因包括输卵管因素、多囊卵巢综合征、子宫内膜异位症、男方因素及不明原因不孕等。夫妻双方染色体结果均正常。

1.2 方法 采用本中心常规方法促排卵、取卵，体外受精及培养，根据患者及胚胎情况决定移植时间，剩余的符合冷冻标准的胚胎进行程序化冷冻。对于移植或冷冻后剩余的非优质胚胎(胚胎碎片较多或者发育速度缓慢)及异常受精胚胎，经患者知情同意后进行囊胚培养。如果有囊胚形成，将符合冷冻标准的扩张期囊胚人工皱缩后进行冷冻保存。

1.2.1 实验分组 人工皱缩后囊胚组和同期行胚胎冻融的卵裂期胚胎组。

1.2.2 囊胚的人工皱缩 采用注射针抽穿法行人工皱缩，即用TPC持卵针固定扩张期囊胚，使内细胞团位置位于6点附近，Humagen注射针从2点附近进入，进入点在两个滋养层上皮细胞的连接处，穿透囊腔后抽出，囊胚自然皱缩。

1.2.3 胚胎冷冻与复苏 人工皱缩后囊胚冷冻保存方法与卵裂期胚胎相同，采用常规的慢速程序化冷冻法，冷冻保护剂为1.5 M丙二醇和0.1 M蔗糖，程序降温仪使用FREEZE CONTROL(CL-8800i，澳大利亚)。复苏法采用快速法。对于卵裂期胚胎，复苏后至少有半数以上卵裂球完整视为存活。对于囊胚，复苏后培养2～4 h，囊胚重新扩张到具有正常内细胞团和滋养外胚层形态视为存活。

1.3 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行数据分析，采用χ2检验比较两组复苏率，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

囊胚组解冻囊胚87枚，存活70枚，复苏存活率为80.46%(70/87)，卵裂期胚胎组解冻胚胎186枚，存活154枚，复苏存活率为82.80%(154/186)，两组比较差异无统计学意义(χ2=1.105，P＞0.05)。

3 讨论

慢速程序化冷冻是一种平衡冷冻法，通过交换细胞内外液体从而减少在冷冻过程中因渗透平衡出现问题对细胞造成的损伤。程序化冷冻中使用的冷冻保护剂浓度相对较低，不会对胚胎造成严重的毒性及渗透损伤，因此被认为是一种安全的冷冻方法。近年来发展迅速的玻璃化冷冻法是一种非平衡冷冻法，与程序化冷冻法相比具有便捷、冷冻效果好等优点，但其缺点在于使用的高浓度冷冻保护剂增加了对胚胎的毒性作用，并且有潜在的生物污染可能。有文献报道，慢速程序化冷冻法经改良后对于卵裂期胚胎冻存可达到与玻璃化冷冻相当的效果[4-5]。多年来本中心一直用慢速程序化法冷冻胚胎，对于卵裂期胚胎也一直有着较高的复苏存活率及移植妊娠率。随着囊胚培养和囊胚移植的快速发展，囊胚的冷冻保存成为辅助生殖领域新的研究热点。理论上囊胚腔扩张程度越大其种植潜能越高，然而扩张期囊胚冷冻后复苏效果却不及早期囊胚，囊胚腔的扩张程度明显影响其冷冻效果[6]。囊胚的显著特点就是其囊腔内充满液体，在与冷冻保护剂作用过程中，囊胚脱水皱缩速度较卵裂期胚胎要慢，囊胚腔越大，囊胚液就越多，就越可能减弱冷冻保护剂的作用而导致脱水不充分，在降温及复温过程中囊胚细胞内就更有可能形成冰晶从而影响冷冻效果[7]。为此，有学者依据囊胚的特点，提出人工皱缩的解决办法，通过减少囊腔的液体量以避免因脱水不充分形成冰晶而造成的机械损伤。即在玻璃化冷冻前，用玻璃微细管反复吹打、显微针刺入囊胚腔抽吸及激光打孔、显微针在滋养层上打孔等人工皱缩的方法来减少囊胚腔容积[8-10]。这些研究结果均表明，人工皱缩能明显提高囊胚的玻璃化冷冻效率，提高复苏后囊胚在体外及体内的继续发育能力。本研究中，经显微注射针刺穿囊胚腔使其自然皱缩后，用慢速程序化冷冻方法保存，快速法解冻，囊胚复苏率同样可以达到与卵裂期胚胎相当水平。因此，囊胚在经过显微注射针人工皱缩预处理后再进行慢速程序化冷冻行之有效，可应用于临床。

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R714.13

B

1003—6350（2015）07—1048—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.07.0375

2014-09-18)

柳朝华。E-mail：liuxu8007@163.com