病毒与乳腺癌发生相关性的研究进展

任艳丽，王鑫，谷鸿喜，商庆龙

哈尔滨医科大学微生物学教研室，哈尔滨 150081



病毒与乳腺癌发生相关性的研究进展

任艳丽，王鑫，谷鸿喜，商庆龙

哈尔滨医科大学微生物学教研室，哈尔滨 150081

摘要：乳腺癌是全球发病率最高的女性恶性肿瘤。近年来，病毒感染与乳腺癌发生的相关性研究受到关注。人乳头瘤病毒和Epstein-Barr病毒等多种病毒均在乳腺癌组织中被检出，相关机制研究也支持病毒感染与乳腺癌发生相关这一观点。但目前流行病学研究数据差异较大，对两者相关性的认识存在较大争议。本文总结了相关研究的进展，并分析了目前研究中存在的主要瓶颈问题。

关键词：乳腺癌；人乳头瘤病毒；Epstein-Barr病毒

乳腺癌(breast cancer)是发生在乳腺上皮组织的恶性肿瘤，是女性最常见的恶性肿瘤。2011年全球乳腺癌病例占全部癌症病例的23%，病死例数占9.6%。全球每年新增病例120万。我国乳腺癌发病率也呈逐年上升趋势，每年新增病例占全球新增病例的12.2%[1]。本文就乳腺癌与病毒感染之间的相关性综述如下。

1乳腺癌的病因

目前，乳腺癌的发病原因尚不清楚。流行病学研究发现了与乳腺癌发生风险增加有关的一些高危因素，如月经初潮年龄、绝经年龄、乳腺癌家族史、吸烟、首次妊娠年龄、生育次数、体质指数(body mass index，BMI)、维生素D等[1]。一些病毒如人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)和Epstein-Barr病毒(Epstein-Barr virus，EBV)等在乳腺癌组织中被检出，认为可能与乳腺癌的发生有关。不同研究中病毒检出率的差异较大，尤其是HPV。病毒感染是否是乳腺癌发生的原因目前仍存在争论。乳腺癌相关病毒包括HPV[2]、EBV[3-5]、人疱疹病毒8型(human herpes virus 8，HHV-8)、单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus 1，HSV-1)、HSV-2、小鼠乳腺肿瘤病毒(mouse mammary tumor virus，MMTV)、人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)[6,7]、腺病毒2型(adeno-associated virus type 2，AAD2)、牛白血病病毒(bovine leukemia virus，BLV)等。

2乳腺癌相关病毒

2.1　HPV与乳腺癌发生的相关性研究

2.1.1流行病学支持证据HPV是乳头瘤病毒科乳头瘤病毒属的DNA病毒。高危型HPV包括16、18、31、33等型，能引起宫颈癌、肛门生殖器癌等恶性肿瘤。流行病学数据表明，乳腺癌的发生与病毒感染之间可能存在联系[8]。Simões等发现，约23%的人乳腺癌组织中可检出高危型HPV，尤其是16、18和33型[9]。Wang等发现，乳腺癌中HPV检出率为23.0%(95%CI为21.2%～24.8%)，其中欧洲地区为13.4%(95%CI为10.2%～16%)，北美和澳大利亚地区为42.9%(95%CI为36.4%～49.4%)。该研究中，HPV阳性女性患乳腺癌的概率是HPV阴性女性的5.9倍[2]。

2.1.2相关机制研究研究表明，HPV的E6和E7蛋白在癌组织中持续表达，使p53和pRb失活，参与宿主细胞转化，与其致癌作用密切相关[10,11]。Lawson等发现，在多数侵袭性乳腺癌中可检出HPV16的E6和E7蛋白，且与正常乳腺组织有明显区别，在乳腺癌组织中还存在中空细胞(这种中空细胞被认为是HPV相关宫颈癌的组织学标记，48%的病变者会进展为宫颈上皮内瘤变)。因此，研究者认为乳腺癌也可能是由HPV引起的[12]。Manzouri等发现，HPV和MMTV有一激素应答过程，可促进病毒复制[13]。这与乳腺癌与激素相关这一现象相符，也支持这2种病毒与乳腺癌相关。

2.1.3流行病学反对数据目前，对乳腺癌与HPV相关性的认识存在较大分歧，主要表现在各研究所得数据存在差异，如有的研究在良性和恶性乳腺组织中均检测到病毒核酸，而有的研究没有检到任何型别的HPV。Manzouri等在18.2%的恶性病变标本和13.7%的良性病变标本中检出HPV DNA，其中70%和43%为高危型HPV阳性；恶性标本中检出率最高的是高危型HPV16和低危型HPV11，良性标本中检出率最高的是高危型HPV31和低危型HPV43。由于在良性和恶性乳腺肿瘤中均检出HPV，故研究者认为其在乳腺癌中的作用仍不明确[14]。Joshi等在乳腺癌组织和正常乳腺组织中均检出HPV，但数据差异较大[14]。

2.2　EBV与乳腺癌发生的相关性研究

2.2.1流行病学支持证据全球有近90%的人感染EBV[15,16]。EBV是亲B细胞病毒，与淋巴细胞和上皮细胞起源的肿瘤有关，如Burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和鼻咽癌等。有数据支持EBV与乳腺癌相关，并认为其在乳腺癌早期起重要作用，增加了乳腺癌的发生风险[17-19]。在乳腺癌的病毒学研究中，EBV是最早被检出的病毒。Huo等发现，29.32%的乳腺癌患者存在EBV感染，其中亚洲来源标本检出率为35.25%，美国来源标本检出率为18.72%[17]。Yahia等在55.5%的乳腺癌组织和23%的对照组织中检出EBV DNA[15]。Joshi等用原位杂交法在55%的乳腺癌组织中检测到EBV核抗原1(EBV nuclear antigen 1，EBNA-1)的表达，而对照组织中未检出；采用IgG抗体检测，则病例组和对照组检出率分别为90.9%和81.8%[20]，这一差异也支持EBV感染与乳腺癌发病可能相关。

2.2.2相关机制研究He等发现，EBV衣壳抗原(viral capsid antigen，VCA)和EBNA-1的IgA水平与乳腺癌患病风险相关。在白细胞介素10(interleukin 10，IL-10)CC基因型的女性中，EBNA-1 IgA血清学阳性女性患病风险比阴性女性高。因此，研究者认为EBV可能促进乳腺癌的发生[21]。EBV等整合到宿主细胞基因组可能引起宿主细胞基因和表达产物的改变。Yahia等发现，EBV DNA阳性乳腺癌组织中肿瘤抑制基因——乳腺癌易感基因1(breast cancer 1，early onset，BRCA1)、BRCA2和p14都出现沉默现象[15]。

2.2.3流行病学反对数据部分相关研究数据不支持乳腺癌与EBV的相关性。Kadivar等检测伊朗100份女性乳腺癌样本和42份对照标本时均未检出EBV DNA，用免疫组化(immunohistochemistry, IHC)方法未检测出EBNA-2和病毒潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1，LMP-1)。因此，研究者认为EBV与乳腺癌的相关性不大[22]。另外，由于EBV是潜伏在B细胞中的病毒，人体感染后大多呈隐性感染，故乳腺癌组织中的病毒也可能来自血液细胞。如Perkins等在46%的乳腺癌组织中检出EBV；而在这些阳性标本中，64%在外周血中也检测到EBV。由于在癌组织中EBV检测水平较低，故无法支持EBV与乳腺癌的相关性[23]。Kalkan等在23%的癌组织和35%的对照组织中均检出EBV DNA，且良性与恶性组织中EBV检出水平差别不大，故不支持EBV与乳腺癌发生的相关性[24]。

2.3　MMTV与乳腺癌的相关性研究

2.3.1流行病学支持证据MMTV是一种反转录病毒，能引起小鼠乳腺癌[25]。1971年，Moore等发现60%乳腺癌患者乳汁中存在MMTV样B型颗粒[26]。Mok等在70%乳腺癌标本中发现MMTV样基因序列[25]，但这些序列在人类乳腺癌中起什么作用仍未确定。乳腺癌患者中MMTV样基因序列的检出率为30%～50%。Melana等分析数据显示，1/3的人类乳腺癌研究中检测出MMTV样基因序列[27]；2014年的数据分析也表明，MMTV感染可提高乳腺癌患病风险[28]。

2.3.2流行病学反对数据对MMTV与乳腺癌发生的相关性存在争议。首先，病毒仅在聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)检测中发现，技术本身可能存在局限性；其次，MMTV感染水平低，主要存在于淋巴细胞中，在血清中很难检出[26]；另外，各地病毒检出率差异性也很大，在日本、中国、越南及约40%西方国家的乳腺癌标本中很少检出，欧洲和北美洲很多实验室结果为阴性[26]。

2.4　HSV-1、HSV-2、HCMV和HHV-8与乳腺癌发生的相关性研究

有关HSV-1、HSV-2、HCMV、HHV-8与乳腺癌发生的相关性研究较少，也未形成定论。El-Shinawi等发现，HCMV感染可增加炎性乳腺癌患者的核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)/p65通路[29]。Tsai等发现，乳腺癌中HSV-1的检出率为12.9%，但未检测到HSV-2；HHV-8的检出率为43.8%[30]。还发现HSV-1、HHV-8、EBV、HCMV、HPV均与乳腺癌预后和生存率有关[31]。

3病毒检测方法的进展

目前，病毒检测方法包括抗体检测、原位杂交(insituhybridization，ISH)、IHC、PCR、实时PCR等。除直接检测病毒基因外，还检测病毒产物，如抗体检测，其缺点是易受患者免疫力水平的影响，免疫力差异可直接影响抗体产生。ISH以探针直接探测靶序列分布状况而显示病毒位置，但灵敏度低；IHC灵敏度低；普通PCR和套式PCR灵敏度高；实时 PCR灵敏度高，特异度强，且不需进行PCR产物分离。一般情况下，采用PCR、套式PCR和实时PCR以提高灵敏度和检出率[14]。

近年来，PCR技术得到了很大发展，如实时 PCR、原位PCR、套式PCR、半套式PCR、反转录PCR等。原位PCR结合了普通PCR与原位杂交的优点，可进行核酸检测和细胞定位，但敏感度低。套式PCR则通过运用2对引物，增加了扩增的特异度，但污染的可能性增加。为了提高实验数据的可信度，多采用多种技术联合检测的方式，对样本进行多方位的检测，如IHC与PCR联用，可减少单一方法检测时假阳性或假阴性发生的可能性[13,32]。Heng等用普通PCR与原位PCR联合检测，弥补了敏感度低和核酸污染的问题[33]。PCR、IHC和ISH是目前用于检测病毒最常见的方法。

4目前研究的障碍和瓶颈

目前，虽然有较多流行病学数据和机制研究支持病毒与乳腺癌发生的相关性，但研究仍存在较大的问题，如流行病学数据之间差异较大，这成为研究的障碍和瓶颈。

4.1　流行病学数据的差异性

目前，各地区流行病学数据存在较大差异，如EBV检出率为0%～100%，高危型HPV的检出率为0%～86%，且各地区检测出的HPV型别差异较大[14]。这些差异无法满足研究可重复性的要求。从其他方面进行论证的研究还很少，大多无法提供有力的证据。

4.2　研究数据差异的原因分析

各实验室检测结果受多种因素影响，包括研究方法、地区、样本等。如果地区差异存在，世界各地的病毒感染率应与该地区的乳腺癌发病率成正比，但各地区的研究数据并不支持这一假设[14]。因此，目前主要问题还是研究方法和数据的可靠性。方法学引起的数据差异，分析有以下几方面的原因。

4.2.1假阳性的存在采用PCR，特别是套式PCR检测病毒DNA时，由于拷贝数较大，操作过程更复杂，污染的可能性增加。用PCR检测的核酸无法确认其细胞来源，故检测阳性的乳腺癌组织中病毒核酸也有可能来自血液细胞或淋巴细胞，尤其EBV是亲B细胞病毒。因此，在乳腺组织中检测到EBV时，其原始感染灶可能并非乳腺。尽管可用原位PCR进行细胞内病毒核酸检测，但仍不可靠。用PCR和原位PCR检测同一样本，PCR检测率普遍比原位PCR高，其弊病是敏感度下降。

4.2.2假阴性的存在在将组织DNA提取用于PCR的过程中，多种因素可导致假阴性的形成，包括提取产物不纯或提取量太少、DNA酶污染、试剂残留、PCR引物和杂交探针的灵敏度或特异度不高、各地区流行株序列差异所致的引物效率差异等。标本处理方法也可导致假阴性结果产生，如石蜡包埋组织中病毒检出率较新鲜组织低，可能是石蜡标本处理后核酸发生降解；标本反复冻融导致核酸降解。

4.3　突破瓶颈的可能方法

有研究指出，如果确认病毒与乳腺癌的相关性，需符合以下几个方面：①病毒在乳腺癌中的检出率应高于正常组织；②病毒感染应先于癌症发生；③病毒与乳腺癌的相关性应在大多数研究中具有可重复性；④乳腺癌高发区的病毒感染率也应较高；⑤乳腺癌发生应与病毒感染程度存在剂量效应；⑥病毒能感染人类乳腺上皮组织，且能改变乳腺上皮细胞，同时在动物模型中能引起肿瘤；⑦预防病毒感染可减少乳腺癌的发生[14]。

未来研究首先要探索解决的是方法学问题。目前，流行病学检测数据之间的差异较大，因此迫切需要建立切实可行的统一检测方法，为乳腺癌的病毒感染学说提供有力的数据证明。除在癌组织中寻找病毒存在外，还可从不同癌组织中的病毒载量差异、各地区流行株的序列差异、病毒标记的差异及癌组织与正常组织的差异等方面着手，寻找病毒致癌作用的证据。另外，机制研究和动物模型研究也可增加相关证据的支持。

5结语

本文仅就病毒与乳腺癌相关性的理论研究进展及相关流行病学数据进行了总结。病毒感染与乳腺癌的发生有一定的相关性，这一观点有机制研究和部分流行病学数据支持，但受到部分流行病学数据反对。目前，这一现状仍没有实质性的进展，研究进展仍以不同地区的数据更新为主。方法学问题的解决可能是未来突破研究瓶颈的关键点之一。明确病毒感染与乳腺癌发生的相关性，将为乳腺癌防治提供理论突破，具有重大的理论和社会意义。

参考文献

[1]Asif HM, Sultana S, Akhtar N, Rehman JU, Rehman RU. Prevalence, risk factors and disease knowledge of breast cancer in Pakistan [J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2014, 15(11): 4411-4416.

[2]Wang T, Chang P, Wang L, Yao Q, Guo W, Chen JH, Yan T, Cao C. The role of human papillomavirus infection in breast cancer [J]. Med Oncol, 2012, 29(1): 48-55.

[3]Agborsangaya CB, Lehtinen T, Toriola AT, Pukkala E, Surcel HM, Tedeschi R, Lehtinen M. Association between Epstein-Barr virus infection and risk for development of pregnancy-associated breast cancer: joint effect with vitamin D [J]? Eur J Cancer, 2011, 47(1): 116-120.

[4]Aguayo F, Khan N, Koriyama C, González C, Ampuero S, Padilla O, Solís L, Eizuru Y, Corvalán A, Akiba S. Human papillomavirus and Epstein-Barr virus infections in breast cancer from Chile [J]. Infect Agent Cancer, 2011, 6(1): 7.

[5]He JR, Song EW, Ren ZF. Research advancement on relationship between Epstein-Barr virus and breast cancer [J]. Ai Zheng, 2009, 28(8): 827-830.

[6]Richardson AK, Cox B, McCredie MR, Dite GS, Chang JH, Gertig DM, Southey MC, Giles GG, Hopper JL. Cytomegalovirus, Epstein-Barr virus and risk of breast cancer before age 40 years: a case-control study [J]. Br J Cancer, 2004, 90(11): 2149-2152.

[7]Cox B, Richardson A, Graham P, Gislefoss RE, Jellum E, Rollag H. Breast cancer, cytomegalovirus and Epstein-Barr virus: a nested case-control study [J]. Br J Cancer, 2010, 102(11): 1665-1669.

[8]Ghaffari SR, Sabokbar T, Meshkat Z, Fereidooni F, Dastan J, Rafati M, Zendehdel K. Tracing human papilloma virus in breast tumors of Iranian breast cancer patients [J]. Breast J, 2011, 17(2): 218-219.

[9]Simões PW, Medeiros LR, Simões Pires PD, Edelweiss MI, Rosa DD, Silva FR, Silva BR, Rosa MI. Prevalence of human papillomavirus in breast cancer: a systematic review [J]. Int J Gynecol Cancer, 2012, 22(3): 343-347.

[10]Frega A, Lorenzon L, Bononi M, De Cesare A, Ciardi A, Lombardi D, Assorgi C, Gentile M, Moscarini M, Torrisi MR, French D. Evaluation of E6 and E7 mRNA expression in HPV DNA positive breast cancer [J]. Eur J Gynaecol Oncol, 2012, 33(2): 164-167.

[11]Aceto GM, Solano AR, Neuman MI, Veschi S, Morgano A, Malatesta S, Chacon RD, Pupareli C, Lombardi M, Battista P, Marchetti A, Mariani-Costantini R, Podestà EJ. High-risk human papilloma virus infection, tumor pathophenotypes, and BRCA1/2 and TP53 status in juvenile breast cancer [J]. Breast Cancer Res Treat, 2010, 122(3): 671-683.

[12]Lawson JS, Glenn WK, Heng B, Ye Y, Tran B, Lutze-Mann L, Whitaker NJ. Koilocytes indicate a role for human papilloma virus in breast cancer [J]. Br J Cancer, 2009, 101(8): 1351-1356.

[13]Manzouri L, Salehi R, Shariatpanahi S, Rezaie P. Prevalence of human papilloma virus among women with breast cancer since 2005-2009 in Isfahan [J]. Adv Biomed Res, 2014, 3: 75.

[14]Joshi D, Buehring GC. Are viruses associated with human breast cancer? Scrutinizing the molecular evidence [J]. Breast Cancer Res Treat, 2012, 135(1): 1-15.

[15]Yahia ZA, Adam AA, Elgizouli M, Hussein A, Masri MA, Kamal M, Mohamed HS, Alzaki K, Elhassan AM, Hamad K, Ibrahim ME. Epstein Barr virus: a prime candidate of breast cancer aetiology in Sudanese patients [J]. Infect Agent Cancer, 2014, 9(1): 9.

[16]Richardson AK, Currie MJ, Robinson BA, Morrin H, Phung Y, Pearson JF, Anderson TP, Potter JD, Walker LC. Cytomegalovirus and Epstein-Barr virus in breast cancer [J]. PLoS One, 2015, 10(2): e0118989.

[17]Huo Q, Zhang N, Yang Q. Epstein-Barr virus infection and sporadic breast cancer risk: a meta-analysis [J]. PLoS One, 2012, 7(2): e31656.

[18]Mazouni C, Fina F, Romain S, Ouafik L, Bonnier P, Brandone JM, Martin PM. Epstein-Barr virus as a marker of biological aggressiveness in breast cancer [J]. Br J Cancer, 2011, 104(2): 332-337.

[19]He JR, Tang LY, Yu DD, Su FX, Song EW, Lin Y, Wang SM, Lai GC, Chen WQ, Ren ZF. Epstein-Barr virus and breast cancer: serological study in a high-incidence area of nasopharyngeal carcinoma [J]. Cancer Lett, 2011, 309(2): 128-136.

[20]Joshi D, Quadri M, Gangane N, Joshi R, Gangane N. Association of Epstein Barr virus infection (EBV) with breast cancer in rural Indian women [J]. PLoS One, 2009, 4(12): e8180.

[21]He JR, Chen LJ, Su Y, Cen YL, Tang LY, Yu DD, Chen WQ, Wang SM, Song EW, Ren ZF. Joint effects of Epstein-Barr virus and polymorphisms in interleukin-10 and interferon-γ on breast cancer risk [J]. J Infect Dis, 2012, 205(1): 64-71.

[22]Kadivar M, Monabati A, Joulaee A, Hosseini N. Epstein-Barr virus and breast cancer: lack of evidence for an association in Iranian women [J]. Pathol Oncol Res, 2011, 17(3): 489-492.

[23]Perkins RS, Sahm K, Marando C, Dickson-Witmer D, Pahnke GR, Mitchell M, Petrelli NJ, Berkowitz IM, Soteropoulos P, Aris VM, Dunn SP, Krueger LJ. Analysis of Epstein-Barr virus reservoirs in paired blood and breast cancer primary biopsy specimens by real time PCR [J]. Breast Cancer Res, 2006, 8(6): R70.

[24]Kalkan A, Ozdarendeli A, Bulut Y, Yekeler H, Cobanoglu B, Doymaz MZ. Investigation of Epstein-Barr virus DNA in formalin-fixed and paraffin-embedded breast cancer tissues [J]. Med Princ Pract, 2005, 14(4): 268-271.

[25]Mok MT, Lawson JS, Iacopetta BJ, Whitaker NJ. Mouse mammary tumor virus-like env sequences in human breast cancer [J]. Int J Cancer, 2008, 122(12): 2864-2870.

[26]Moore DH, Charney J, Kramarsky B, Lasfargues EY, Sarkar NH, Brennan MJ, Burrows JH, Sirsat SM, Paymaster JC, Vaidya AB. Search for a human breast cancer virus [J]. Nature, 1971, 229(5287): 611-614.

[27]Melana SM, Nepomnaschy I, Hasa J, Djougarian A, Djougarian A, Holland JF, Pogo BG. Detection of human mammary tumor virus proteins in human breast cancer cells [J]. J Virol Methods, 2010, 163(1): 157-161.

[28]Wang F, Hou J, Shen Q, Yue Y, Xie F, Wang X, Jin H. Mouse mammary tumor virus-like virus infection and the risk of human breast cancer: a meta-analysis [J]. Am J Transl Res, 2014, 6(3): 248-266.

[29]El-Shinawi M, Mohamed HT, El-Ghonaimy EA, Tantawy M, Younis A, Schneider RJ, Mohamed MM. Human cytomegalovirus infection enhances NF-κB/p65 signaling in inflammatory breast cancer patients [J]. PLoS One, 2013, 8(2): e55755.

[30]Tsai JH, Tsai CH, Cheng MH, Lin SJ, Xu FL, Yang CC. Association of viral factors with non-familial breast cancer in Taiwan by comparison with non-cancerous, fibroadenoma, and thyroid tumor tissues [J]. J Med Virol, 2005, 75(2): 276-281.

[31]Tsai JH, Hsu CS, Tsai CH, Su JM, Liu YT, Cheng MH, Wei JC, Chen FL, Yang CC. Relationship between viral factors, axillary lymph node status and survival in breast cancer [J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2007, 133(1): 13-21.

[32]Duò D, Ghimenti C, Migliora P, Pavanelli MC, Mastracci L, Angeli G. Identification and characterization of human papillomavirus DNA sequences in Italian breast cancer patients by PCR and line probe assay reverse hybridization [J]. Mol Med Rep, 2008, 1(5): 673-677.

[33]Heng B, Glenn WK, Ye Y, Tran B, Delprado W, Lutze-Mann L, Whitaker NJ, Lawson JS. Human papilloma virus is associated with breast cancer [J]. Br J Cancer, 2009, 101(8): 1345-1350.

·综述·

Corresponding author. SHANG Qing-Long, E-mail: shangqingl@163.com

Current research progress on viral impacts for breast cancer

REN Yan-Li，WANG Xin，GU Hong-Xi，SHANG Qing-Long

Department of Microbiology, Harbin Medical University， Harbin 150081， China

Abstract:Breast cancer is the most common malignant carcinomas for females in the world. Recently, potential viral factors for breast cancer have been emphasized, as human papillomavirus, Epstein-Barr virus and the others were detected in breast carcinomas. There is no clear conclusion for the relationship between viruses and breast carcinogenesis for discrepancy among the data reported from different studies. The main obstacles and bottleneck of studies are analyzed in this review.

Key words:Breast carcinoma；Human papillomavirus；Epstein-Barr virus

收稿日期：(2014-12-31)

通信作者：商庆龙

基金项目：国家自然科学基金(81000726)