双丁酰环腺苷酸抑制甲状腺癌细胞株FTC－133增殖＊

王玉林，王 辉，巴 颖

（大连医科大学附属第一医院：1.普外科；2.超声科；3.内分泌科，大连116011）

甲状腺癌是内分泌系统的常见恶性肿瘤之一［1］，占全身肿瘤疾病的1%。近年来，随着生活方式的改变、饮食习惯变化，甲状腺癌的发病率逐年上升，吸引人们的关注和重视［2］。陈竟文等［3］回顾分析复旦大学附属中山医院的病例资料发现，甲状腺癌的发病率近年有明显升高的趋势。因此，努力开发抑制甲状腺癌细胞生长作用的新药，并进一步探讨其内在的作用机制是当前医学研究的重要任务。环磷酸腺苷（cAMP）是细胞内重要的信号转导因子，在细胞增殖和分化的调控中起重要作用。研究发现cAMP可抑制或促进肿瘤细胞增殖、诱导分化［4］，其对甲状腺癌的影响及机制尚不明确［5］。本研究利用cAMP类 似 物，双 丁 酰 环 腺 苷 酸（dibutyryl cyclic adenosine monophosphate，dbcAMP），观察cAMP对甲状腺癌细胞株FTC－133增殖能力的影响，探讨其潜在机制。

1 材料与方法

1.1 材料 DMSO，dbcAMP，胰岛素（Sigma），β－actin抗体（Sigma），Raf1抗体（Cell signaling technology），二抗（HRP）偶联的山羊抗兔IgG（北京鼎国生物试剂公司），预染蛋白marker（北京鼎国生物试剂公司），DMEM－F12培养液，胎牛血清（GIBICO公司）、100U/mL青霉素（GIBICO 公司）和100 mg/L链霉素（GIBICO公司），谷氨酰胺（GIBICO公司），四甲基偶氮唑蓝（MTT，Sigma），牛促甲状腺激素（TSH），Thermo CO2培养箱（USA），iMark酶标仪（Bio－Rad，USA），流式细胞仪（BD FACSCom），荧光定量 PCR仪（ABI 7500HT），甲状腺癌FTC－133细胞株购自美国模式菌种收集中心（ATCC）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将FTC－133细胞接种于含10U/L的TSH、10mg/L的胰岛素、15%的胎牛血清、2mmol/L的谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的 DMEM－F12（1∶1）培养基中，培养基pH 值调到7.2～7.4。在37℃、5%CO2条件下细胞培养箱进行培养。FTC－133细胞在60mm培养皿中呈单层贴壁生长，细胞呈梭形，极其不规则，细胞之间有明显的粘连，有少量细胞突起。随着培养的时间增加，细胞数量增长，有时会出现复层生长，有细胞聚集现象。

1.2.2 MTT比色法检测FTC－133细胞生长抑制率 调整对数生长期的FTC－133细胞密度为5×104个/mL，每孔100μL接种到于96孔板内，细胞培养箱中培养12h后，处理组分别加入0.5、1.0、2.0mmol/L dbcAMP，对照组不加任何试剂。给药24h和48h后使用MTT法检测吸光度值（A值），设定波长为490nm，每组包括6个孔，实验重复3次。增殖抑制率（%）＝（1－实验组A值/对照组A值）×100%。

1.2.3 生长曲线的绘制 取对数生长期的FTC－133细胞，调整细胞密度为1×104个/mL，接种到24个25mL培养瓶，每瓶100μL，细胞培养箱中培养 12h 后，将 0.5、1.0、2.0 mmol/L dbcAMP加入上述培养瓶，每个浓度6瓶，剩余作为对照，继续培养，每24小时每组取1瓶，消化计数，以时间为横坐标、细胞数为纵坐标绘制生长曲线。

1.2.4 流式细胞术检测细胞周期 dbcAMP处理共同培养24h的FTC－133细胞，加入0.25%胰酶进行消化、吹打细胞，当细胞脱落后，加入含血清培养基，中和胰酶作用，1 000r/min离心5min、弃上清液并收集细胞沉淀，用PBS清洗，加入75%的乙醇1mL进行细胞固定，4℃过夜。将FTC－133细胞的浓度调整为5×105个/mL，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗3次后，加入500μL PBS含50μg/mL 溴化 乙锭（EB），100μg/mL RNase A，0.2%Triton X－100，4℃避光孵育30min，用流式细胞仪进行检测。用FACSCom软件分析实验结果，统计G0/G1期、S期和G2/M期细胞的百分比。实验重复4次，计算平均值和标准差。

1.2.5 通过反转录的定量PCR（RT－qPCR）、蛋白免疫印迹实验（Western Blotting）方法检测 FTC－133细胞中 Raf1水平 FTC－133细胞处于对数生长期时，经过酶消化后，计数6×105个/mL的浓度分为2组，包括实验组（加入0.5mmol/L的dbcAMP）和对照组（不加dbcAMP），培养24h。抽提细胞的总RNA，逆转录呈cDNA后，采用sybr green法进行PCR扩增，通过湘桂定量以2－△△Ct值代表基因的相对表达强度。抽提细胞总蛋白，采用蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行蛋白浓度测定，然后进行电泳、转膜，用 Raf1抗体（1∶500）、β－actin抗体（1∶2 000）进行免疫杂交，最后显影和定影，经Biorad凝胶成像分析系统扫描成像，蛋白相对表达强度采用Quantity One软件进行定量。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行数据分析处理，计量资料用±s表示，组间比较采用t检验，多组间均值比较采用单因素方差分析，检验水准α＝0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 处理组及时间对FTC－133细胞生长抑制率的影响 随着浓度增加、时间延长，FTC－133细胞株A值越低，dbcAMP对细胞增殖的抑制作用越明显，呈时间－剂量依赖性，见表1、图1。

表1 处理组及时间对FTC－133细胞吸光度的影响

2.2 FTC－133细胞生长曲线绘制 由生长曲线可知，对照组FTC－133细胞在试验的第2天即表现出良好增殖趋势，第3天时细胞数已显著多于各浓度dbcAMP组。处理组中，随着时间的延长及浓度的增加，dbcAMP对FTC－133细胞生长的抑制作用越明显。

2.3 细胞周期检测结果 对照组的FTC－133细胞的G0/G1期为（60.75±1.52）%，S期细胞数量为（30.19±0.98）%，G2/M 期细胞的数量为（8.85±0.48）%。处理组中，使用0.5 mmol/L的dbcAMP处理 FTC－133细胞后，FTC－133细胞的G0/G1期［（62.25±1.21）%］没有显著的变化，但是FTC－133细胞的S期［（10.25±0.42）%］细胞数量明显减少，G2/M 期［（27.45±0.75）%］细胞的数量显著增加（P＜0.01），见图2。

图1 处理组及时间对FTC－133细胞增殖抑制率的影响

图2 不同浓度dbcAMP下FTC－133细胞生长曲线

2.4 dbcAMP对FTC－133细胞中Raf1表达的影响 相对于对照组，实验组Raf1mRNA相对表达水平为0.413±0.071；其蛋白相对表达0.813±0.074，明显低于对照组的1.104±0.133，差异具有统计学意义（P＜0.01），见图3。

图3 dbcAMP显著抑制Raf1mRNA和蛋白的表达

3 讨 论

cAMP是细胞内重要的第二信使，具有调节细胞增殖、分化等广泛的生物学功能。cAMP及其衍生物dbcAMP能够使细胞的形态、行为发生逆转性改变，有效抑制恶性肿瘤生长，对多种体外培养的癌细胞有一定的诱导分化作用。因此设法提高肿瘤细胞内腺嘌呤核糖核苷酸（AMP）水平，抑制增殖、诱导分化，成为大多数研究使用的手段［6－7］。dbcAMP是cAMP衍生物，能有效提高细胞内AMP水平，它是通过化学方法对环磷腺苷的结构进行改造，在其分子中加入2个丁酞基制备而成的，因其具有高亲脂性，且对酸碱环境比较稳定，可被口服吸收，穿过细胞膜进入细胞内，经腺苷酸环化酶（adenylate cyclase，AC），转换为环磷腺苷。Chrenek等［8］发现，dbcAMP能显著抑制兔输卵管上皮细胞增殖。本实验通过MTT试验、曲线生长试验和细胞周期检查，发现dbcAMP可显著抑制甲状腺癌细胞株FTC－133的增殖能力，并促进其凋亡，抑制增殖的能力与时间、浓度呈正相关。

ERK/MAPK（extracellular signal－regulated kinase，mitogen－activated protein kinase）是一条高度保守的，由3组苏氨酸－精氨酸蛋白激酶模块构成的信号通路，它通过Raf蛋白（A－raf，B－Raf和 Raf1）、MEK1/2蛋白、ERK1/2蛋白先后磷酸化级联，将分子信号从细胞膜向细胞核传递并放大，参与调节包括细胞增殖、迁移、凋亡等在内的多种重要细胞进程［9－10］。有研究发现蛋白酶体抑制剂抗凋亡的机制是通过p38MAPK途径激活Nrf2的细胞核移位，进而导致GCLC的诱导作用和谷胱甘肽生成的连锁反应［11］。研究发现，过表达cAMP可通过激活Ras抑制 Raf－1的活化，从而负性调节［12］。通过 RTPCR、Western Blotting，检测到dbcAMP显著抑制了Raf1mRNA及蛋白水平的表达，提示dbcAMP抑制FTC－133细胞增殖能力的途径之一是抑制ERK/MAPK通路。也有研究认为甲状腺癌细胞的增殖抑制与有丝分裂促成因子（MPF）活性降低直接相关［13］。

综上所述，本文发现dbcAMP能够通过Raf1抑制ERK/MRPK通路，干扰甲状腺癌细胞株FTC－133的增殖能力、促进其凋亡，为今后深入研究dbcAMP的抑癌机制和开发肿瘤治疗药物提供理论基础。

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