枸杞黄酮对H2O2损伤的血管内皮细胞NO及NOS作用的研究＊

廖国玲，马 磊，曾 泰

（宁夏医科大学检验学院，银川750004）

血管内皮细胞是血液与组织进行物质交换的屏障，它通过合成与释放大量的血管活性物质来调节血管的基础张力，维持血管功能的正常。血管内皮细胞的损伤和功能失调是动脉粥样硬化（AS）发生的始动环节［1］，对其损伤保护的研究是目前的热点。自由基、活性氧、脂质过氧化物、过氧化氢（H2O2）等均可引起内皮细胞的损伤。抗氧化剂作为可终止自由基产生的一类化学物质，被认为在预防心脑血管疾病及癌症的发生中扮演着极其重要的作用［2］。对中草药中天然活性成分的研究表明，一些黄酮类化合物具有抗氧化和抗癌作用。张自萍等［3］研究表明：宁夏产的枸杞黄酮化合物中芦丁和绿原酸含量均高于河北、内蒙古枸杞，且有明显的抗脂质过氧化作用［4］。本研究选择具有调节免疫能力、降血糖、降血脂、抗肿瘤、抑菌、抗氧化等作用的枸杞黄酮化合物作为课题研究的对象［5－6］，深入研究其对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）氧化应激损伤的保护机制。本实验通过对枸杞黄酮对H2O2损伤的血管内皮细胞一氧化氮（NO）及一氧化氮合酶（NOS）作用的研究，为开发利用枸杞及其有效成分提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验药材与试剂 枸杞由宁夏农科院提供，陈淑华研究员鉴定，其总黄酮由本研究室分离和纯化［7］，含量经测定为100mg/mL；新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所；四唑盐（MTT）试剂为Sigma公司产品；NO试剂盒及NOS试剂盒购自南京建成生物工程研究所；其余均为国产试剂（分析纯级）。

1.1.2 实验仪器 仪器CO2培养箱为美国Sheldon公司产品，倒置显微镜Olympus产品，酶标仪为美国Me2tertech公司产品。

1.2 方法

1.2.1 提取物制备 采用80%乙醇，60℃超声提取，减压浓缩，经HPD－600型大孔树脂，乙醇洗脱，减压浓缩后，超纯水定容为枸杞黄酮溶液［7－8］。以芦丁为标准液绘制标准曲线，铝盐法测定总黄酮的浓度为100mg/mL。

1.2.2 细胞培养 复苏冻存的HUVEC细胞，加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基，于37℃饱和湿度、5%CO2培养箱中静置培养，将生长良好的HUVEC细胞用0.25%的胰蛋白酶消化1～2min后，用培养基终止消化，轻轻吹打细胞壁制成细胞悬液，进行传代培养用于实验。

1.2.3 实验分组 正常对照组：只加相应体积培养液；H2O2损伤模型组（H2O2组）：在培养液中加入1 000μmol/L H2O2诱导损伤4h；枸杞黄酮干预组：依次分为枸杞黄酮低浓度组、枸杞黄酮中浓度组、枸杞黄酮高浓度组，先分别在培养液中加入终浓度为100、200、400mg/L的枸杞黄酮溶液孵育24h，再加入1 000μmol/L H2O2诱导损伤4h；维生素C（VitC）阳性对照组（VitC组）：在培养液中先加入终浓度为20mg/L的VitC孵育24h，再加入1 000μmol/L H2O2诱导损伤4h。

1.2.4 MTT法检测HUVEC活力 实验结果以 MTT的光密度（OD）值计算内皮细胞生长抑制率（IR）。IR＝（对照组OD－实验组OD）/对照组OD×100%。

1.2.5 细胞培养液中过氧化物丙二醛（MDA）、人总一氧化氮合成酶（TNOS）、诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）和NO的测定 按实验分组所述方法处理后，收集细胞培养上清液，分别按MDA、NOS和NO测定试剂盒中说明书上所述的方法分别检测MDA、TNOS、iNOS和NO的活性，试验重复3次，每次4个复孔，取均值。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0统计软件，计量资料用±s表示，组间比较采用t检验，多组间比较用单因素方差分析，采用q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 枸杞黄酮对H2O2诱导脐静脉内皮细胞活力的影响H2O2处理HUVEC后其细胞IR为38.8%，与正常对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；与H2O2组比较，枸杞黄酮低、中、高浓度组IR显著降低（P＜0.01），与枸杞黄酮呈剂量依赖性，见表1。

表1 枸杞黄酮对H2O2诱导脐静脉内皮细胞活力的影响（n＝4）

表2 枸杞黄酮对H2O2诱导脐静脉内皮细胞MDA、NOS、iNOS活性及NO含量的影响（±s，n＝4）

表2 枸杞黄酮对H2O2诱导脐静脉内皮细胞MDA、NOS、iNOS活性及NO含量的影响（±s，n＝4）

a：P＜0.01，与正常对照组比较；b：P＜0.01，c：P＜0.05，与H2O2组比较。

组别 NO（μmol/L）TNOS（U/mL）iNOS（U/mL）MDA（nmol/mL）正常对照组 55.69±8.12b 1.10±0.10b 0.81±0.06b 0.418±0.042b H2O2 组 19.05±6.27a1.78±0.07a1.33±0.06a2.216±0.062a VitC组 39.11±3.09b 1.32±0.06b 0.99±0.06b 1.304±0.105b枸杞黄酮低浓度组 28.15±5.71c 1.59±0.04b 1.16±0.08b 1.796±0.155b枸杞黄酮中浓度组 33.25±3.94b 1.49±0.07b 1.07±0.05b 1.674±0.054b枸杞黄酮高浓度组 37.27±3.72b 1.40±0.07b 1.01±0.06b 1.427±0.106b

2.2 枸杞黄酮对H2O2诱导脐静脉内皮细胞活力培养上清液中MDA、TNOS、iNOS活性和NO含量的影响与正常对照组比较，H2O2组细胞培养液中细胞内MDA含量增高，差异有统计学意义（P＜0.01）。而枸杞黄酮各浓度组细胞 MDA生成减少，其变化程度与枸杞黄酮浓度呈正比，与H2O2组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。H2O2组细胞培养液中细胞内NO含量降低，TNOS（结构型和诱导型）活性升高，尤以iNOS活性升高为主，与正常对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。而枸杞黄酮各浓度组细胞内TNOS、iNOS活性降低，NO生成增多，与H2O2组比较差异有统计学意义（P＜0.01），见表2。

3 讨 论

造成血管内皮细胞损伤的因素有很多，其中氧化应激是造成血管内皮损伤较为重要的因素之一，H2O2是体内常见的一种活性氧，可促进自由基生成，直接作用于细胞膜脂质，造成脂质过氧化反应，致使细胞膜的损伤［9］。MTT参与活细胞的能量代谢，直接反映活细胞的数量和活性［10］。机体内存在抗氧化系统包括酶系统和非酶系统，NO为内皮源性舒血管因子，由NOS催化L－精氨酸和分子氧而合成。内皮细胞有两种NOS，即iNOS（诱导型）、cNOS（内皮型），外源刺激可影响NOS活性或表达，进而影响NO产生与释放。iNOS在无病理性刺激时表达通常较低或无表达，其表达调节主要在转录水平，许多物质可上调或下调表达。cNOS在细胞中结构性表达，一些病理性刺激对其表达也有调节作用［11］。乌兰格日乐等［12］研究发现枸杞黄酮的抗氧化作用与其结构有关，羟基化是其抗氧化活性不可缺少的。研究证明黄酮类化合物可显著降低高脂大鼠血浆氧化低密度脂蛋白（oxLDL）和MDA水平，提高超氧化物歧化酶（SOD）活力，进而达到保护内皮细胞的功效［13］。贾刚等［14］研究发现不同种类的枸杞黄酮对于细胞的氧化应激具有完全不同的作用，而且黄酮对细胞氧化应激的作用与其浓度呈现出很好的相关性。

本研究采用H2O2诱导HUVEC建立内皮细胞氧化损伤模型。研究结果表明H2O2组内皮细胞的存活率明显下降，IR为38.8%。加入不同浓度梯度的枸杞黄酮各组其细胞生长抑制率呈下降趋势，即枸杞黄酮呈剂量依赖性（P＜0.01）。内皮细胞在H2O2刺激下，与正常对照组相比，MDA含量明显增加；加入100、200、400mg/L枸杞黄酮预先干预，与H2O2组相比，MDA含量明显降低（P＜0.01）。而MDA是自由基与生物膜多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化的产物，它的含量反映氧自由基的水平及脂质过氧化程度，因此，MDA含量的降低说明枸杞黄酮可通过抑制过氧化而减轻H2O2造成的细胞损伤；同样，H2O2组NO较正常对照组比较较低，随着枸杞黄酮的量增加呈上升趋势，损伤后iNOS表达增强，枸杞黄酮各组iNOS表达与NO的生成呈负相关，差异有统计学意义（P＜0.01）。推测NO升高与cNOS表达有关［11］，即枸杞黄酮可能促进了血管壁cNOS的表达，使iNOS的表达下降，有利于生理性的NO合成并发挥作用，使其减轻H2O2对HUVEC的氧化作用，增加NO的生成，其保护机制可能为通过清除自由基，有效提高机体抗氧化酶的活性来修复受损的内皮细胞，调节细胞表达NOS，催化促进NO的合成有关。与此同时，本研究也推测枸杞黄酮在调节NO对内皮细胞保护的同时，过高的NO水平也会协同H2O2而引起血管内皮细胞的损伤，即枸杞黄酮通过调节NO保护内皮细胞具有双面性，而且已经有不少动物实验发现某些黄酮化合物具有毒性，且其毒性与促氧化作用密不可分［15］。这种诱导细胞损伤可能与以下机制有关：（1）NO作用于铁蛋白，影响细胞呼吸及能量代谢；参与过氧化脂质的形成［16］，加速过氧化亚 硝 基 阴 离 子（ONOO－）等 羟 自 由 基（O H·）等氧化剂的生成；（2）NO及其中间反应产物还可激活核修复多聚酶，抑制DNA合成，间接激活蛋白酶激活受体，引起无效修复，最终导致生物能量耗竭，致使细胞死亡［17］。综上所述，枸杞黄酮对 H2O2损伤的血管内皮细胞NO及NOS作用的研究的作用还有待于进一步研究。

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