人MicroRNA335的预测靶基因CCL11CCL26及SOX4的鉴定＊

温志红，代 艳，何 爽

（广西壮族自治区人民医院：1.儿科；2.康复科，南宁530021）

微小RNA（MicroRNA）是在真核生物中发现的长度为18～25个碱基的非编码单链RNA，其在进化过程中高度保守并具有广泛的生物学功能。MicroRNA与靶基因3′端非翻译区（3′UTR）的碱基完全或不完全互补配对，通过降解信息RNA或抑制翻译过程从而调节靶基因的表达［1］。因此，寻找MicroRNA调控的靶基因，是研究MicroRNA功能的一个关键切入点。经生物信息学软件预测嗜酸细胞趋化因子1（CCL11）、嗜酸细胞趋化因子3（CCL26）、SOX4是人 MicroRNA335（has－miR－335）的靶基因，本研究将用分子生物学方法对3个基因进行验证。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 PCR引物（美国Integrated DNA Technologies公司）；Pre－miRTMmiRNA335Precursor、pMIR－REPORT真核表达质粒（美国Ambion公司）；PCR试剂盒、T4DNA连接酶试剂盒、大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞、Lipofectamine 2000转染试剂盒（美国Invitrogen公司）；限制性核酸内切酶（美国NEB公司）；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒（美国QIAGEN公司）；DMEM培养基、胎牛血清（美国Gibco公司）；双荧光素酶报告基因检测系统试剂（美国Promega公司）。

1.1.2 实验设备 PCR仪（美国Eppendorf公司），二氧化碳恒温培养箱（美国Thermo公司），synergyTM 2多功能酶标仪（美国BioTek公司）。

1.2 方法

1.2.1 靶基因预测 应用网络在线生物信息学分析软件mi－Randa和TargetScan，选择2个软件共同预测为has－miR－335靶基因且与免疫相关的CCL11、CCL26、SOX4作为研究对象。

1.2.2 CCL11、CCL26、SOX4基因3′UTR真核表达载体的构建 CCL11、CCL26基因3′UTR 真核表达载体 pMIR－REPORT－CCL11 3′UTR、pMIR－REPORT－CCL26 3′UTR已成功构建［2］。真核表达载体pMIR－REPORT－SOX4－3′UTR构建方法见参考文献［2］；扩增SOX4基因3′UTR全长的上游引物5′－GGC CAC TAG TGA AAC GAA AAG GAC A－3′，下游引物5′－GGC CGC CGG CAC ACT GGT GGC AGG T－3′，扩增产物序列长度1 845bp。

1.2.3 质粒提取及纯化 Pre－miRTMmiRNA335Precursor、pMIR－REPORT真核表达质粒提取和纯化方法见参考文献［2］。质粒经美国辛辛那提儿童医学中心测序室测定，序列正确。

1.2.4 细胞培养 复苏人293T7/17细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，接种适当数量细胞于24孔板，37℃二氧化碳恒温培养箱培养48～72h，待细胞融合70%后进行转染。

1.2.5 细胞转染 阴性对照为空pMIR－REPORT真核表达载体，阳性对照质粒自行合成［3］。将真核表达质粒pMIR－REPORT－CCL11 3′UTR、pMIR－REPORT－CCL26 3′UTR、pMIRREPORT－SOX4 3′UTR、阳性对照质粒分别与合成的 PremiRTMmiRNA335Precursor或阴性对照共转染到293T7/17细胞系，每组设置3个复孔，严格按照说明书进行操作。

1.2.6 荧光素酶检测 共转染48h后同时检测CCL11、CCL26、SOX4基因3′UTR萤火虫（firefly）和海洋腔肠（renilla）荧光素酶活性，并与阴性对照对比，实验重复3次，操作参照说明书。

1.3 统计学处理 用GraphPad Prism5.0软件进行统计分析、制图，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

由图所见，hsa－miR－335可显著降低克隆 SOX4 3′UTR 的报告基因活性（P＜0.01），表达下调30%左右，但并不影响CCL11 3′UTR、CCL26 3′UTR荧光素酶活性。初步认为hsamiR－335对SOX4有靶向调控作用，而对CCL11、CCL26并无此作用，见图1。

图1 CCL11、CCL26、SOX4基因相对荧光素酶活性值

3 讨 论

人类1/3的基因由 MicroRNA调控［4］，由此认为其在高级真核生物内对基因表达的调控作用可能和转录因子一样重要。MicroRNA通过降解靶基因mRNA或者转录后抑制靶基因表达而发挥作用，目前已证实MicroRNA参与细胞增殖、分化、凋亡，生物发育、脂肪代谢等生命过程中的一系列重要进程，并与免疫系统疾病、心血管疾病、糖尿病、肿瘤等多种疾病的发生、发展密切相关［5－9］。因此，预测及验证 MicroRNA靶基因，对研究MicroRNA的功能及其参与的生物学过程具有非常重要意义。

既往研究发现白细胞介素13（IL－13）刺激人气道上皮细胞，部分MicroRNA表达上调，部分 MicroRNA表达下降，而MicroRNA335是表达下调最明显的一个。众所周知，IL－13是参与哮喘等变态反应性疾病的重要炎症介质［10］，气道上皮细胞参与哮喘气道炎症的形成，由此推测MicroRNA335可能与哮喘等免疫性疾病有关。动物实验及人体试验均发现MicroRNA确实参与哮喘气道炎症和气道高反应的形成［11－13］。CCL11、CCL26是嗜酸性粒细胞（EOS）选择性化学趋化剂，通过与CC家族趋化因子受体3（CCR3）相结合，吸引EOS向炎症部位聚集并活化［14］，会致哮喘患者气道炎症加重及气道高反应。研究发现SOX4影响前B细胞的生存，提示SOX4与免疫相关［15］。这就是虽然生物信息学软件预测 MicroRNA335的靶基因很多，本研究选择CCL11、CCL26、SOX4作为研究对象的原因。

由于一个MicroRNA可以调节多个靶基因，一个靶基因也可以有数个MicroRNA与其配对，给靶基因的预测和证实带来了困难［16］。MicroRNA靶基因芯片筛选技术的应用，为疾病的发病机制和诊断治疗的研究提供了新的思路，但该技术存在信息质量的稳定性差、费用较高等缺陷限制了它的广泛应用［17］。通过生物信息学预测 MicroRNA靶基因，然后通过分子生物学方法和技术加以验证仍然是目前MicroRNA靶基因寻找的最常用的实验方法［18－19］。当前，利用荧光素酶报告基因系统体外检测实验寻找或验证MicroRNA靶基因已成为不可或缺的一种快速实验技术。

本研究通过靶基因预测软件miRanda和TargetScan进行生物信息学分析发现CCL11、CCL26、SOX4可能是hsa－miR－335的靶基因。通过构建报告基因重组质粒pMIR－REPORTCCL11 3′UTR、pMIR－REPORT－CCL26 3′UTR、pMIR－REPORT－SOX4 3′UTR，并分别与Pre－miRTMhsa－miR－335共转染到293T7/17细胞系；同时共转染Pre－miRTMmiRNA335Precursor，并设阴性对照质粒、阳性对照质粒以保证实验的可靠性。运用双荧光素酶报告基因检测系统测定Has－mir－335对pMIR－REPORT－CCL11 3′UTR、pMIR－REPORT－CCL26 3′UTR、pMIR－REPORT－SOX4 3′UTR的直接作用，通过观察荧光素酶的表达强度初步证实hsa－miR－335靶向调控SOX4，但对CCL11、CCL26并无影响，提示生物信息学软件对MicroRNA靶基因的预测具有假阳性，需通过分子生物学实验加以验证。

体外实验证实了hsa－miR－335对靶基因SOX4有良好的可调控性，为后续hsa－miR－335与哮喘等免疫性疾病的功能研究提供实验基础。

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