黄芩苷对动脉粥样硬化模型大鼠NF－κB TAFI及ACE2表达水平影响

毕明辉，程 诚，李 鹏，吴平生

（1.南方医科大学研究生学院，广州510515；2.厦门市中医院心血管科，福建厦门361009；3.中山大学附属第五医院内科，广东珠海519000）

近年来，心脑血管病的发病率逐年升高，其中由动脉粥样硬化引发疾病的病死率逐年上升，防治动脉粥样硬化，研究其病因、病理机制成为研究重点。研究表明，中药对动脉粥样硬化有显著防治作用，黄芩苷是从黄芩根中提取获得的黄酮类单体化合物［1－2］。有研究表明，黄芩具有多种药理作用［3－4］，如抗氧化、抗炎、抑制平滑肌增殖、调节免疫等，黄芩苷亦具有多种药理作用，如调节血脂、恢复凝血－纤溶系统平衡等。但黄芩苷对于动脉粥样硬化的防治作用及其机制有待于进一步研究。本研究通过构建动脉粥样硬化大鼠模型，观察黄芩苷对动脉粥样硬化模型大鼠主动脉壁细胞内核因子（NF－κB）、纤溶抑制物（TAFI）及血管紧张素转换酶2（ACE2）表达水平影响，探讨黄芩苷防治动脉粥样硬化作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级 Wistar大鼠，雄性，体质量250.0～350.0g，适龄，健康，共40只，均购自南方医科大学实验动物中心，饲养在南方医院实验动物中心，饲养温度控制在25℃，湿度7%，自动通风器保持室内通风。普通饲料及高脂饲料均购自广东省医学实验动物中心。

1.1.2 实验药物 黄芩苷（山东鲁抗大禹药业有限公司），TAFI发色底物试剂盒（美国DIAGNOSTlCA公司），维生素D3（浙江仙琚制药股份有限公司，批号：国药准字H20058981），其他试剂均为国产分析纯产品。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组及给药 购进 Wistar大鼠后，先喂养1周普通饲料，后随机分为4组，每组10只，即假手术组、模型组、黄芩苷高剂量组、黄芩苷低剂量组。假手术组大鼠给予普通饲料，剩余组别大鼠给予高脂饲料喂养。实验第7天后大鼠进行主动脉球囊损伤手术［5］，在实验开始时于大鼠的右下肢肌内注射维生素D3（针剂30万U/kg），隔1个月肌内注射1次，周期4个月，建立动脉粥样硬化大鼠模型。假手术组、模型组大鼠肌内注射生理盐水2mL，每天1次；黄芩苷高剂量组肌内注射黄芩苷150mg·kg－1·d－1，每天1次；黄芩苷低剂量组肌内注射黄芩苷100mg·kg－1·d－1，每天1次。给药8周后，处死所有动物，发色底物法测定血浆TAFI的活性，免疫组织化学法测定NF－κB、ACE2表达水平。

1.2.2 测定血浆TAFI的活性 在给药第8周末，大鼠空腹12h后，心脏取血，按照试剂盒步骤测定TAFI活性。

1.2.3 免疫组织化学法测定 测定NF－κB、ACE2表达水平：取血后，脱臼处死大鼠，取主动脉，置于10%甲醛溶液中，固定24h后，取出、包埋、切片（4μm），然后将组织切片置于涂有多聚赖氨酸的玻片上，37℃烤片，过夜，4℃保存备用。免疫组织化学操作步骤参考文献［6－7］方法。实验结果判定：NF－κB、ACE2染色阳性细胞质中有棕黄色或者褐色颗粒。每只大鼠选取4张切片，每张切片随机选取5个视野（×200）阳性着色区域，然后采用图像软件测定阳性染色细胞棕色颗粒的平均吸光度值（OD值）。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行分析，计量资料用±s表示，组间比较采用t检验，检验水准α＝0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 黄芩苷对动脉粥样硬化模型大鼠血浆TAFI表达影响实验过程中，各组大鼠采食饮水等活动均正常，毛色光亮柔滑，生命体征良好，饮食、毛色及外观未见明显异常。与假手术组比较，其余各组大鼠TAFI活性均明显升高（P＜0.05）；经过黄芩苷治疗后，黄芩苷高、低剂量组TAFI明显低于模型组（P＜0.05），见表1。

2.2 黄芩苷对动脉粥样硬化模型大鼠NF－κB表达水平影响与假手术组比较，其余各组 NF－κB明显降低（P＜0.05）；经过黄芩苷灌胃给药治疗后，与模型组比较，黄芩苷高、低剂量组NF－κB均明显升高（P＜0.05），见表1。

2.3 黄芩苷对动脉粥样硬化模型大鼠ACE2表达水平影响与假手术组比较，其余各组ACE2活性明显升高（P＜0.05）；经过黄芩苷灌胃给药治疗后，与模型组比较，黄芩苷高、低剂量组ACE2活性均明显降低（P＜0.05），见表1。

表1 黄芩苷对动脉粥样硬化模型大鼠血浆TAFI、NF－κB、ACE2活性表达影响（±s）

表1 黄芩苷对动脉粥样硬化模型大鼠血浆TAFI、NF－κB、ACE2活性表达影响（±s）

a：P＜0.05，与假手术组比较；b：P＜0.05，c：P＜0.01，与模型组比较。

组别 n TAFI（μg/L） NF－κB ACE2活性假手术组10 27.56±0.10 167.52±7.82 75.28±7.32模型组 10 34.38±5.26a66.69±9.26a148.63±9.15a黄芩苷高剂量组 10 31.07±2.53ab 128.47±8.45ac103.84±8.53ab黄芩苷低剂量组 10 30.11±1.74ab 112.75±9.14ab111.35±8.46ab

2.4 黄芩苷对大鼠主动脉免疫组织化学染色NF－κB表达的影响 大鼠主动脉NF－κB免疫组织化学染色，光镜下观察，假手术组 NF－κB OD 值为0.100±0.008；模型组 NF－κB表达明显降低，OD值为0.350±0.014，斑块内可见大量浅紫红色阳性颗粒；黄芩苷高剂量组OD 值为0.270±0.010，NF－κB表达明显增加，与模型组相比差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组相比，黄芩苷低剂量组NF－κB的表达增加差异也有统计学意义（P＜0.05），见图1。

2.5 黄芩苷对大鼠主动脉免疫组织化学染色ACE2表达的影响 主动脉ACE2免疫组织化学染色，光镜下观察，假手术组ACE2 OD值为0.120±0.006。模型组ACE2表达明显增加，OD值为0.430±0.020，斑块内可见大量棕黄色阳性颗粒，以细胞质为主，细胞核内有少量表达。黄芩苷高剂量组OD值为0.230±0.012，黄芩苷低剂量组OD 值为0.310±0.011，ACE2表达明显减少，与模型组相比差异都有统计学意义（P＜0.01），见图2。

图1 黄芩苷对动脉粥样硬化模型大鼠NF－κB活性表达水平影响

图2 黄芩苷对动脉粥样硬化模型大鼠ACE2活性表达水平影响

3 讨 论

目前关于动脉粥样硬化的发病机制尚未阐明，有研究报道，高血压、血脂异常、炎症、凝血－纤溶系统平衡失调是常见高危因素［6］。因此，防治动脉粥样硬化，研究其病因、病理机制成为重点。有研究报道［3－4］，黄芩苷具有多种药理作用，尤其在调节血脂、恢复凝血－纤溶系统平衡等方面。本研究通过构建动脉粥样硬化大鼠模型，观察黄芩苷对动脉粥样硬化模型大鼠NF－κB、TAFI及ACE2表达水平影响，探讨黄芩苷防治动脉粥样硬化作用机制。

有研究表明，肾素－血管紧张素－醛固酮系统在动脉粥样硬化发生、发展中具有重要作用，高血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）水平通过提高基质金属蛋白酶活性，促进血管平滑肌迁移及促进合成炎症因子并激活炎症信号的传导通路等途径促进动脉粥样硬化斑块形成［7］。ACE2水解 AngⅡ生成 Ang（1－7），水解产物具有强烈舒张血管效应，在炎症及血管平滑肌增殖等过程中可发挥有益效应。是心血管系统的保护因子。ACE2通过降低AngⅡ水平，生成Ang（1－7）发挥舒张血管的作用。本研究结果表明，与假手术组相比，其余各组大鼠主动脉壁ACE2表达水平差异有统计学意义（P＜0.05）；经过黄芩苷治疗后，黄芩苷药物组ACE2表达水平与模型组比较，差异有统计学意义。与黄芩苷低剂量组比较，黄芩苷高剂量组TAFI改善更优。提示，黄芩苷可通过上调ACE2表达抗动脉粥样硬化。

肝脏可合成TAFI，TAFI是一种羧肽酶样活性蛋白，通常无活性。在体内纤溶酶、凝血酶等可激活TAFI，从而起到抗纤溶作用。有研究表明［8］，在动脉粥样硬化发生、发展过程中，TAFI水平随着动脉粥样硬化程度加重而升高，说明动脉粥样硬化中有TAFI参与。本研究结果表明，与假手术组相比，其余各组大鼠TAFI活性均明显升高（P＜0.05）；经过黄芩苷治疗后，与模型组比较，黄芩苷药物组TAFI明显低于模型组（P＜0.05）。与黄芩苷低剂量组比较，黄芩苷高剂量组TAFI改善更优。TAFI主要作用于纤维蛋白羧基端，导致纤溶酶无法与纤维蛋白结合，抑制了纤溶活性，溶栓时间延长，血栓形成危险升高。

动脉粥样硬化发展过程中，NF－κB信号转导通路被激活，将会过量表达，调控黏附分子细胞因子、免疫受体、急性期蛋白等基因表达，在炎性反应中具有重要作用［9－11］。本研究结果表明，与假手术组相比，其余各组大鼠主动脉壁细胞内核因子NF－κB表达水平差异有统计学意义（P＜0.05）；经过黄芩苷治疗后，黄芩苷药物组NF－κB表达水平与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），与黄芩苷低剂量组比较，黄芩苷高剂量组 NF－κB表达差异有统计学意义（P＜0.05）。

本研究结果显示，黄芩苷抗动脉粥样硬化机制可能通过下调TAFI水平，恢复凝血－纤溶系统平衡；下调NF－κB表达，减少炎性反应；上调ACE2表达，舒张血管。综上所述，模型组大鼠TAFI、NF－κB表达水平明显升高，ACE2表达水平明显降低，黄芩苷可能通过下调TAFI，NF－κB表达，上调 ACE2表达，发挥其抗动脉粥样硬化作用。

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