MicroRNA－21在单侧输尿管梗阻大鼠间质纤维化肾脏组织中的表达及意义＊

雷学智，徐小龙，胡建敏，孙光曦，李 民，郭 颖，陈 桦，张焕标，赵 明（南方医科大学珠江医院器官移植科，广州510282）

慢性肾脏病（CKD）在中国已经成为最为严重的公共卫生问题之一［1－2］，而肾间质纤维化（RIF）是CKD发展为终末期肾衰竭的共同路径。大量研究证明转化生长因子－β1（TGF－β1）/Smad信号通路在器官纤维化的发展过程中起着主要作用［3］，且有报告指出TGF－β1/Smad信号通路可能通过调控下游多种microRNA，从而控制上皮间质转化（EMT）及纤维化［4－6］。目前国内关于miRNA－21在肾脏纤维化机制中的作用报道较少，本实验通过测定miRNA－21在单侧输尿管梗阻（UUO）大鼠肾脏组织中的表达，初步探讨其在TGF－β1/Smad3信号通路中的机制及意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选择成年SD雄性大鼠20只，体质量200～220g，购于南方医科大学实验动物中心。

1.1.2 主要试剂和仪器 RNAlater试剂（美国Sigma公司），RT primers（上海百力格生物技术有限公司），兔抗Smad3单克隆抗体（美国 Milliproe公司），兔抗α平滑肌肌动蛋白（α－SMA）单克隆抗体（美国 Milliproe公司），兔抗TGF－β1抗体（英国Abcam公司），兔抗Ⅰ型胶原蛋白（Col－Ⅰ），多克隆抗体（英国Abcam公司），免疫组织化学试剂盒（美国St.Louis公司），实时定量PCR引物（上海康成生物）。ViiA 7Real－time PCR System（美国 Applied Biosystems）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组、模型建立及标本收集 20只SD大鼠分为UUO组和假手术组（Sham组），以5%异戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉满意后，腹部皮肤备皮消毒，取左侧腹部肾区切口进入腹腔，UUO组大鼠游离左侧输尿管，并在其上1/3水平处及肾门处以4－0手术线结扎，逐层缝合关闭腹腔。Sham组大鼠只分离但不结扎左侧输尿管。将上述大鼠在建模后第3天、第7天在腹腔麻醉下以0℃生理盐水灌注血管，并取两组大鼠左侧肾脏，将部分肾脏组织置于10%福尔马林中固定，部分肾脏置于5倍体积的RNA later试剂中4℃孵育过夜后－20℃保存。

1.2.2 观察及检测

1.2.2.1 肾脏组织苏木素－伊红（HE）、Masson染色观察 将固定在10%福尔马林中的肾脏组织进行脱水、透明、浸蜡、包埋，制成4μm厚石蜡切片，按常规方法进行HE、Masson染色。切片HE染色观察肾小管上皮细胞空泡变性，肾小管萎缩和扩张、间质水肿、纤维化及炎性细胞浸润等评价肾小管间质损伤情况。Masson染色肾脏纤维化半定量评分［7］：在200倍视野下，随机选取每张切片5个互不重叠的肾小管间质视野，根据视野中胶原染色阳性面积占整个视野面积的百分比进行半定量分析，标准为：阳性面积小于2%，0分；阳性面积2%～＜11%为轻度病变，1分；阳性面积11%～＜21%为中度病变，2分；阳性面积21%～30%为重度病变，3分；阳性面积大于30%为极重度病变，4分。

1.2.2.2 肾脏组织免疫组织化学SP染色观察 大鼠肾组织切片脱蜡和梯度乙醇脱水，在3%H2O2室温下孵育阻断内源性H2O2酶，95℃煮沸行抗原修复，胎牛血清工作液封闭，一抗分别加入抗 TGF－β1（1∶100）、抗Smad3（1∶200）、抗α－SMA（1∶200）、抗Col－Ⅰ（1∶200），4℃孵育过夜，再依次加入生物素偶联二抗、辣根过氧化酶标记链霉素卵白素、DAB显色、苏木素复染，最后依次进行梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。在光学显微镜200倍视野下观察，每张切片随机取5个互不重叠视野拍照。Image－Pro Plus 6.0软件分析每张照片中阳性染色面积。TGF－β1、Smad3、Col－Ⅰ和α－SMA表达量以阳性面积百分比表示。

1.2.2.3 实时荧光 PCR检测 microRNA－21的表达 UUO组和Sham组大鼠第3天及第7天肾脏组织RNA抽提按照Trizol试剂说明书进行，并使用紫外吸收对抽提出的RNA进行纯度和浓度检测，测得 A260/A280比值1.8～2.1，变性琼脂糖凝胶电泳显示总RNA完整。使用抽提出的肾脏组织RNA进行cDNA合成，配备RT反应液后在PCR扩增仪进行RT反应。实时荧光定量 PCR（Real－time qPCR）检测组织中microRNA－21，使用 U6作为内参，引物设计 U6，F：5′－GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T－3′，R：5′－CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT－3′；rno－miR－21，GSP：5′－GGG GGG TAG CTT ATC AGA CTG－3′，R：5′－CAG TGC GTG TCG TGG AGT－3′，将 所 有 cDNA 样 品 分 别 配 置 Real－time qPCR反应体系，5 000r/min短暂离心。将8μL混合液加到384－PCR板对应的每个孔中，再加入对应的2μL cDNA，短暂离心混合，在设置PCR程序前将准备好的PCR板放在冰上，将上述384－PCR板置于Real－time PCR仪上进行PCR反应。U6指标均按以下程序进行：95℃，10min，40个PCR循环。为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按95℃，10 s；60℃，60s；95℃，15s，从60℃缓慢加热到99℃（仪器自动进行－Ramp Rate为0.05℃/s）。各样品的目的 miRNA和内参（U6）分别进行 Real－time qPCR 反应，数据采用2－△△CT法进行分析，Sham组2－△△CT为1作为基准校正。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0软件进行分析，计量资料数据用±s表示，采用单因素方差分析，相关性分析采用Spearman法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠肾脏病理结果 观察HE染色切片，Sham组肾单位大小形态未见异常；UUO组建模后3d见肾小管轻度扩张、小管上皮空泡样变，间质轻度水肿并散在炎症细胞，建模后7d即可观察到明显的肾间质增宽、胶原沉积增加、肾小管萎缩等，炎症细胞浸润明显，证明建模成功。在光镜下观察Masson染色大鼠肾脏组织，Sham组第3天和第7天肾单位及间质未见异常；UUO组建模后第3天，可见肾小管管腔轻度扩张，部分间质可见少量淡蓝色胶原组织沉积，UUO组建模后第7天，肾小管较第3天模型组明显扩张，间质水肿增宽明显伴单核细胞及淋巴细胞广泛浸润，间质胶原纤维进行性增多、面积扩大、蓝染加重（图1）。UUO组和Sham组3d、7d组织Masson染色胶原阳性面积评分组间比较差异有统计学意义（F＝194.228，P＜0.01），UUO组3d和7d肾脏组织纤维化程度评分明显高于同时期Sham组（P＜0.01），UUO组7d纤维化面积与3 d相比显著增多（P＜0.01），见图2。

图1 两组大鼠肾脏组织病理形态（Masson×200）

2.2 不同时间点肾脏中microRNA－21的表达 建模后3、7d UUO和Sham组肾组织中miRNA－21表达组间存在差异［（2.33±0.46）vs.（3.50±0.41），F＝61.381，P＜0.01］；两两比较发现，大鼠肾组织中miRNA－21在UUO组3d和7d的表达量与Sham组（1.00±0.00）比较明显升高（P＜0.01），7d UUO组肾组织中miRNA－21较3dUUO组明显升高（P＝0.008）。

图2 两组大鼠肾脏Masson染色胶原面积评分

2.3 两组大鼠肾脏组织不同时间点 TGF－β1、Smad3、Col－Ⅰ、α－SAM免疫组织化学表达 Sham组大鼠3d及7d肾脏组织中TGF－β1仅在肾小管上皮细胞中少量表达，间质中无表达，且各时间点无明显变化。与Sham组相比，UUO组3d、7d TGF－β1在肾小管上皮细胞和组织间质表达面积随时间逐渐增多，阳性染色逐渐加深。UUO组和Sham组3d、7d肾脏组织TGF－β1阳性面积组间差异有统计学意义（F＝423.844，P＜0.01），UUO组TGF－β1阳性面积与同时期Sham组比较差异有统计学意义（P＜0.01），UUO组7dTGF－β1阳性面积较UUO组3d增多（P＜0.01），见图3A。

Sham组大鼠3d及7d肾脏组织中Smad3表达无明显变化，表达于少部分肾小管上皮细胞中。UUO组3d、7dSmad3与Sham组相比，在肾小管上皮细胞、组织间质表达面积明显增多，且强阳性表达于UUO组7d组织。UUO组和Sham组各时间点肾脏组织Smad3阳性面积组间差异有统计学意义（F＝768.544，P＜0.01），UUO组Smad3阳性面积明显多于同时期Sham组（P＜0.01），UUO组7dSmad3阳性面积多于UUO组3d（P＜0.01），见图3B。

Sham组Col－Ⅰ在肾小管间质少量表达，与同时间Sham组比较，UUO组大鼠肾脏组织Col－Ⅰ蛋白表达面积明显增多，建模后时间越长，阳性面积表达越多（图4）。组间Col－Ⅰ表达面积差异有统计学意义（F＝1108.079，P＜0.01），各组间两两比较，UUO组Col－Ⅰ阳性面积多于同时期Sham组（P＜0.01），UUO组7dCol－Ⅰ阳性面积多于 UUO 组3d（P＜0.01）（图3C）。α－SMA在Sham 组阳性面积较少，UUO组α－SMA在肾组织间质中表达面积随建模后时间延长增多，7d阳性染色最深（图4）。组间α－SMA表达面积具有明显差异有统计学意义（F＝292.363，P＜0.01），各组间两两比较，UUO组α－SMA阳性面积多于同时期Sham组（P＜0.01），UUO组7d α－SMA阳性面积明显较UUO组3d增多（P＜0.01）（图3D）。

图3 两组大鼠肾组织 TGF－β1、Smad3、Col－Ⅰ和α－SMA蛋白阳性面积比较

图4 两组大鼠肾组织不同时间点Col－Ⅰ和α－SMA蛋白表达比较（免疫组织化学染色×200）

2.4 相关性分析 TGF－β1、Smad3与肾组织中 miRNA－21呈正相关（r＝0.799、0.849，P＜0.01），肾组织 miRNA－21与肾组织 纤 维 化 程 度、Col－Ⅰ 和 α－SMA 呈 正 相 关（r＝0.888、0.882、0.896，P＜0.01）。

3 讨 论

纤维化是以细胞外基质（ECM）过度积聚、成纤维细胞增生，以及肾单位萎缩消失等为病理特点［4］，是肾、心、肺、肝等器官发生渐进性疾病，最终发展为终末期器官衰竭的共同通路，但是对于肾脏纤维化发生的分子机制认识尚不完全明确［8］。MicroRNAs是一类广泛存在于动植物基因组中的功能性非编码小分子RNA，主要功能是通过与靶基因mRNA特定位点结合，在转录水平参与基因的表达和调控，近年来研究发现，microRNA参与几乎每个细胞的生理及病理发生过程，而且miRNAs的异常调节与包括CKD在内的众多人类疾病密切相关。

UUO大鼠是肾脏炎症及RIF公认经典模型，HE染色显示随着UUO建模时间延长，肾间质损害逐渐加重，Masson染色也观察到实验组术后间质纤维化程度加重，证明大鼠肾脏间质纤维化模型建模成功。TGF－β1/Smad3是纤维化发生机制中重要的信号通路之一［3］，TGF－β1通过下游受体激活型介质Smad3、Smad2正向调控致纤维化基因表达从而介导EMT［9］，另一方面，大部分RIF来源于损伤肾组织通过Ⅱ型EMT而来的肾小管上皮细胞，通过EMT机制，肾小管上皮细胞失去顶点－基底极性，形态变细长，破坏基底膜从而侵入肾小管间隙，并表达α－SMA等间皮细胞标志，产生以Ⅰ、Ⅲ型胶原为主的ECM［10］。在本实验中，3dUUO组肾组织纤维化评分较低，肾脏组织中 TGF－β1、Smad3蛋白少量表达，且α－SMA 和 Col－Ⅰ亦有阳性表达，说明是肾脏纤维化和EMT的初期阶段，但是7dUUO组肾脏组织masson染色纤维化评分较3d组明显升高，肾组织中 TGF－β1、Smad3、α－SMA、Col－Ⅰ阳性面积较3dUUO组显著增多、染色加深，可见随着建模后时间延长，TGF－β1/Smad3信号通路被激活，组织纤维化和EMT程度伴随TGF－β1、Smad3表达增强进行性加重。

在肾实质细胞，很多miRNAs接受TGF－β1的调控，例如miRNA－21、miRNA29家族、miRNA93、miRNA377、miR－216a、miRNA200家族［11］，在RIF发展过程中，上述miRNAs表达是通过 TGF－β1/Smad3这一信号通路实现［12－13］，而不是依赖Smad2［12］，保守的 Smad3结合在 miRNA－21、miRNA29、miRNA－192启动子区域位点，所以miRNAs可能是TGF－β1/Smad3信号通路调控肾脏纤维化的重要下游介质［4］。本次实验发现，UUO组大鼠肾脏组织中miRNA－21在建模后3d、7d呈增加趋势，并与TGF－β1/Smad3蛋白、肾组织纤维化评分、α－SMA、Col－Ⅰ呈正相关，所以 TGF－β1/Smad3可能通过上调miRNA－21从而诱导EMT导致RIF。

综上所述，UUO大鼠肾组织中miRNA－21随纤维化程度加重表达上调，TGF－β1/Smad3信号通路可能通过正向调控miRNA－21从而诱导RIF。随着检测技术及对miRNA进一步研究，miRNA有望成为预测及诊断CKD新型标志物。

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