戊二醛固定的异种血管的先天性免疫机制研究①
2015-03-18刘洁琳万居易李殿坤杜兰平辛志飞许秀芳李温斌首都医科大学附属北京安贞医院北京市心肺血管疾病研究所北京100029
张 颖 龚 达 辛 毅 崔 巍 刘洁琳 万居易 刘 飒 李殿坤 杜兰平 辛志飞 许秀芳李温斌 (首都医科大学附属北京安贞医院,北京市心肺血管疾病研究所,北京 100029)
戊二醛是一种蛋白交联剂,广泛用于处理生物瓣膜、生物血管和心包等[1-3]。T 细胞活化和巨噬细胞是细胞免疫介导的急性器官移植排斥反应早期过程中的主要环节[4-6]。机体的防御体系包括天然免疫(固有免疫)和获得性免疫。前者作用迅速,通过许多途径和机制来保护自己免受有害物质的侵袭。
先天性免疫生来就有,是遗传的。它是机体在长期种系发育和进化过程中不断地与入侵的微生物做斗争而逐渐建立起来并传给后代的。参与异种免疫排斥的固有免疫细胞种类很多。单核细胞和中性粒细胞在移植后早期迅速浸润移植器官,但主要发挥免疫效应的是巨噬细胞和NK 细胞等。单核吞噬细胞包括血液中的单核细胞和组织器官中的巨噬细胞,是异种器官植入后早期浸润移植物的炎症细胞,对移植物内皮细胞具有显著的黏附和杀伤效应,此效应机制十分复杂。固有免疫细胞发挥免疫效应,特别是激活和损伤移植器官内皮细胞时,需要天然抗体和补体的存在,目前一些研究却表明固有免疫细胞可独自识别并激活异种内皮细胞[7-11]。
本实验主要研究异种(猪)血管大鼠皮下包埋不同时间点新鲜未处理组和戊二醛组巨噬细胞CD68、补体C3、先天性抗体IgG 等变化,探讨这些指标在排斥反应中的变化规律。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要动物及试剂 一抗:兔抗大鼠CD68 单克隆抗体(英国Abcam 公司),C3 兔抗人多克隆抗体(中杉金桥生物技术有限公司),鼠抗人IgG 单克隆抗体(博士德生物工程有限公司);EnVision 两步法试剂盒(Dako REALTMEnVisiontm Detection SystemPeroxidase/DAB+,Rabbit/Mouse)为DAKO 公司(丹麦)产品。
1.1.2 主要仪器 TB-718 生物组织包埋机;Leica RM2235 组织切片机(德国);Leica HI1220 烤片机(德国);Leica ST5020 全自动组织脱水机(德国);Olympus bx51 显微镜(日本)。
1.2 HE 染色 按照常规HE 染色方法染色。
1.3 免疫组化二步法染色 (1)将切片脱蜡至水:二甲苯Ⅰ15 min;二甲苯Ⅱ15 min;100%酒精Ⅰ10 min;100%酒精Ⅱ5 min;95%酒精5 min;90%酒精5 min;80%酒精5 min;70%酒精5 min;蒸馏水洗10 min×2 次;(2)抗原修复:枸缘酸缓冲液放入高压锅,水开后放入切片。盖好锅盖,继续加热,喷气后计时2 min,同时改用中火(140℃~160℃),2 min后关火,马上放气,打开锅盖降温至室温;(3)PBS洗3 次,每次2 min。(4)双氧水封闭:3%H2O2室温10 min(注意避光),再用PBS 洗3 min ×3 次;(5)滴加一抗(C3 抗体稀释度为1∶500,其余抗体稀释度为1∶400),4℃冰箱过夜;(6)取出切片,室温下放置30 min,PBS 溶液洗3 min×3 次;滴加二抗:室温30 min;(7)显色反应:先PBS 溶液洗3 min ×2次,再室温DAB 显色1~5 min,显微镜下观察,观察目标出现阳性后,蒸馏水洗终止反应;(8)自来水充分冲洗,苏木素复染,盐酸酒精分化,氨水返蓝;(9)脱水透明:70%酒精3 min×1 次;80%酒精3 min×1 次;90%酒精3 min×1 次;95%酒精3 min×1 次;100%酒精Ⅰ3min;100% 酒精Ⅱ3 min;二甲苯Ⅰ3min;二甲苯Ⅱ3 min;(10)中性树胶封片;(11)采集图像及图像分析:高倍镜下拍摄10 个视野,将采集的图像应用Image-pro Plus 5.1 图像分析系统进行分析,所得数据作免疫组织化学染色阳性信号累积光密度(IOD),以IOD 值作为组织表达的定量标准。累积光密度(IOD)=平均光密度(AOD)×阳性面积(A)。
1.4 统计学处理 利用SPSS18 统计软件进行动物实验两组皮下包埋移植后各时间点的各指标参数均值和标准差;所有数据以±s 表示,并利用t 检验分别进行参数间的显著性检验,设定P <0.05 时具有显著性差异。用GraphPad Prism 5 进行数据处理分析。
2 结果
2.1 HE 染色结果 HE 染色结果显示:新鲜组术后可见大量细胞,尤其是术后第12 天最明显,其次是术后第30 天;戊二醛组比较新鲜组术后细胞数较少。见图1。
2.2 CD68 免疫组化 CD68 免疫组化结果显示:新鲜组术后第12、30 天染色较深,反映排斥反应较强,而术后第60 天排斥明显减弱。戊二醛组术后第4、12、30、60 天比新鲜组明显减弱。见图2。
图1 新鲜组和戊二醛组HE 染色Fig.1 HE staining results of fresh group and glutaraldehyde group
2.3 C3 免疫组化 C3 免疫组化结果显示:戊二醛组术后第4 天和第60 天比新鲜组明显减弱,术后第12 天变化不明显。见图3。
2.4 IgG 免疫组化 IgG 免疫组化结果显示:新鲜组术后第12、30 天染色较深,反映排斥反应较强,而术后第60 天排斥明显减弱。戊二醛组术后第4、12、30、60 天比新鲜组明显减弱。见图4。
2.5 CD68、C3 和IgG IOD 值变化趋势 高倍镜下拍摄10 个视野测量IOD 值结果显示:新鲜组术后第4 天IOD 值开始上升,到第12 天或第30 天升高到峰值,术后第60 天降低。戊二醛组与新鲜组相比,IOD 在各个时间点均较低。见图5。
图2 新鲜组和戊二醛组CD68 免疫组化Fig.2 CD68 immunohistochemistry results of fresh group and glutaraldehyde group
图3 新鲜组和戊二醛组C3 免疫组化Fig.3 C3 immunohistochemistry results of fresh group and glutaraldehyde group
图4 新鲜组和戊二醛组IgG 免疫组化Fig.4 IgG immunohistochemistry results of fresh group and glutaraldehyde group
图5 新鲜组和戊二醛组CD68、C3 和IgG 术后4、12、30、60 天IOD 变化趋势Fig.5 Changes of CD68,C3 and IgG in fresh group and glutaraldehyde group at 4th,12th,30th,60th day after operations
3 讨论
异种来源的心血管替代材料在植入人体前,均需要一定的交联处理以增强组织稳定性及降低免疫原性,但是戊二醛是一种蛋白交联剂,它可使胶原蛋白和弹性蛋白分子内及分子间形成稳定的交联键,封闭原有的抗原决定簇,从而降低生物移植材料中弹性纤维和胶原纤维的抗原性[1,2]。戊二醛是目前临床上较为常用的生物移植材料处理剂,广泛用于处理生物瓣膜和生物血管,以降低弹性纤维和胶原纤维的免疫原性,但是戊二醛处理的血管平滑肌和内皮细胞完全保留。血管平滑肌和内皮细胞仍具有较强的抗原物质。戊二醛具有以下缺点:如不能稳定有效稳定弹力纤维、导致钙化和血栓。经其处理的材料远期易出现钙化、退行性变和机械强度下降等不良改变,最终导致移植物衰败,其中弹力纤维破坏与钙化是血管移植物衰败的重要原因之一。Isenburg 等[3]认为戊二醛能有效固定胶原纤维,却不能稳定弹力纤维,而未经交联的异种弹力纤维植入人体后易受基质蛋白酶攻击而降解,加重局部炎症反应和钙化程度。研究表明主要原因是戊二醛主要通过结合蛋白质(如胶原纤维)中的赖氨酸残基中的ε-氨基团形成共价键,起交联作用,而弹力纤维中赖氨酸含量极少,故戊二醛对其交联效果差[12,13]。戊二醛还可与胶原蛋白中羟脯氨酸等的羟基作用形成缩醛,生成较牢固的交联键,通过以上两种反应,形成胶原分子的分子内交联与分子间交联。另外,戊二醛产生的游离醛基具有细胞毒作用,直接影响了生物瓣的生物相容性。
Moura 等[14]研究60 只兔子,30 只自体静脉移植,30 只0.19%戊二醛处理同源静脉移植1 h。每一组(n=10)分为术后24 h、14 d 和28 d。结果显示:在移植14 d 和28 d 观察到纤维化,腔静脉造影显示两组在血栓数量无明显差异。在第14 天和28天,组织切片显示内膜增生和分布两组相似,电镜显示24 h 在移植物表面缺少内皮细胞,存在炎症细胞,在一些区域,两组都存在附壁血栓。两组在第14 天和28 天显示内皮细胞覆盖移植物表面伤口,覆盖面积自体移植组比戊二醛处理组大。这项研究表明戊二醛处理的静脉可作为静脉重建替代物。
Sánchez[15]研究证实增加戊二醛浓度来固定心包,能提高机械性能,但是没有增加钙化潜能。新鲜心包处理:戊二醛0.625% 处理7 d (标准),0.625%,1%和3%在4℃处理20 d 和50℃处理另外20 d,固定心包,小鼠皮下包埋50 d,结果显示:3%戊二醛和热处理及3%戊二醛处理后机械性能均超过标准水平,钙化方面无明显变化。应该联合其他降低钙化方法来处理心血管移植物。
免疫反应包括固有免疫反应和适应性免疫反应。固有免疫系统是人体对内源性和外源性致病原产生免疫应答和急性炎症反应的第一道防线[16]。它是机体在长期与外界不断侵人的病原物质相互斗争过程中,逐步进化而建立起来对病原起防御作用的免疫功能,这种免疫功能比特异性免疫更加稳定,并可遗传给下一代。其主要特点是作用快、范围广,第一次与异物相遇即发生反应,起到首先防御作用。如与相应抗原再次相遇,反应并不减弱也不增强。固有免疫系统是由屏障结构、固有免疫细胞和固有免疫分子组成。包括:①机体的天然屏障,如皮肤、纤毛等;②参与免疫反应的细胞,如单核、巨噬细胞、天然杀伤细胞(NK)、树突状细胞(DC)等,其中巨噬细胞是非特异性免疫的重要组成部分,而且也在特异性免疫中也占重要地位;③固有免疫分子:参与免疫反应的活性物质,如补体(如C3 等)、天然抗体(IgG 等)、溶菌酶、干扰素等。先天性免疫应答的特征是:①无特异性,作用广泛;②先天具备;③初次与抗原接触即能发挥效应,但无记忆性;④可稳定遗传;⑤同一物种的正常个体间差异不大。
巨噬细胞(CD68)是体内具有最活跃生物学功能的细胞类型之一,可产生数十种酶、分泌百余种生物活性物质,在免疫防御、免疫自稳和监视、抗原递呈及免疫调节中发挥重要作用。参与并部分介导异种移植排斥反应,虽然激活的巨噬细胞对于移植物的排斥是非常关键的,但是如果没有活化T 细胞的存在,巨噬细胞的定向聚集过程和活化不能完成[9,10]。
天然抗体是指在没有任何抗原主动免疫的情况下,正常机体内天然产生存在的一种免疫球蛋白。天然抗体在维护机体免疫状态平衡、调节生理机能、防御感染、移植、监视肿瘤等多方面具有重要的意义[17-19]。
补体由一组血清蛋白组成,这些蛋白序贯相互激活产生生物活性分子[20,21]。
补体在序列活化过程中所释放出的一些递质及活性片段可直接破坏移植物。补体参与急性、慢性以及超急性排斥反应。另外抗体分子与抗原结合后活化补体,使其更为准确、集中、有效地杀伤靶细胞并且介导杀伤性细胞和巨噬细胞的抗体依赖的细胞毒效应(ADCC)。
我们的实验观察到异种血管CD68、C3 和IgG在术后第12 天、30 天染色较强,排斥反应强,戊二醛组以上指标术后第12 天、30 天染色比新鲜组较弱。我们得出结论:戊二醛固定的异种血管免疫原性下降,但是仍然具有免疫原性,综上所述,寻找新型交联剂以及新的降低免疫原性的解决方法变得更为迫切,需要探索更好的方法来明显削弱排斥反应。
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