多囊卵巢综合征大鼠AMH 表达与胰岛素抵抗的相关性研究

李晓红 闫 宏 温泰芳 (深圳市龙岗区妇幼保健院生殖内分泌科，深圳518172)

PCOS 是一种内分泌障碍性疾病，主要发生在育龄期妇女，发病原因及机理目前尚不明确，临床表现具有高度异质性的特点，主要表现为月经不调、排卵障碍和不孕，主要内分泌特征为高雄激素及高胰岛素血症，AMH 是反映多囊卵巢综合征的一个重要的激素，是卵巢局部的一种重要的调节因子，有学者研究认为AMH 水平随着雄激素的升高而变化［1］，另有学者研究认为PCOS 患者胰岛素抵抗程度与雄激素水平呈相关性［2］。而AMH 与IR 是否有相关性目前报道相对较少，本研究采用RT-PCR 法探讨多囊卵巢综合征大鼠AMH 表达与胰岛素抵抗的相关性。

1 材料与方法

1.1 实验对象 SD 雌性大鼠60 只，随机选择40只采用DHEA 皮下注射法制作PCOS 大鼠模型，作为实验组;20 只正常SD 雌鼠作为对照组。

1.2 实验方法

1.2.1 PCOS 模型制作 23 日龄左右的SD 大鼠皮下注射DHEA 60 mg/(kg·d)，具体方法如下:将DHEA 溶于0.2 ml 甘油中，对照组皮下注射0.2 ml甘油，均于上午10 时连续皮下注射21 d;空白对照组正常饲养，停药后，连续阴道涂片7 d，药物注射结束后，根据大鼠阴道上皮细胞是否存在周期性的变化来判定是否造模成功。

1.2.2 相关激素指标测定 对造模成功的大鼠及正常对照大鼠通过阴道涂片观察周期性变化，选择动情间期的大鼠作为研究对象，晚上8∶ 00 禁食后，并称取体重，第二天通过腹腔注射10%水合氯醛麻醉，心脏取血6～10 ml，血样静置30 min，以3 000 r/min的转速离心10 min，提取上清液。采用放射免疫法测定血清黄体生成素(Luteinizing hormone，LH)和卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone，FSH);采用酶联免疫法测定空腹血糖值(Fasting blood glucose，FPG)、血胰岛素(Fins)和AMH;采用化学发光法测定血清E2、PT。根据HOMA-IR 的计算公式(HOMA-IR=FPG × FINS/22.5)计算HOMA-IR 指数值。所有PCOS 模型均经过病理证实为PCOS 大鼠，根据HOMA-IR 值由大到小排列顺序，前20 只与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，说明为PCOS合并IR 组;后20 只与对照组比较差异无统计学意义(P ＞0.05)，判定为PCOS 无IR 组;对照组20 只。

1.2.3 标本采集及病理检测 对已经采集血清的大鼠进行双侧卵巢解剖，尽量将卵巢周围的附带组织去除干净后置于10%甲醛液中，固定24 h 后进行切片，厚度4 mm，切取卵巢的最大平面进行常规石蜡包埋，分别切取3 片，2 片进行免疫组化检测，1 片进行HE 染色形态学观察。

1.2.4 免疫组化检测 根据DAB 试剂盒的操作步骤进行操作，实验浓度为1∶ 20，AMH 受体表达阳性的判定标准为在细胞质中有棕黄色或棕褐色颗粒出现，采用image analysis-microarray 计算机图像分析系统进行图像分析，随机选择2 000 倍视野下的5个单卵泡视野，半定量分析AMH 的表达水平。阳性单位(PU)=(待测部分的平均灰度-背景平均灰度)/ 256 ×100，256 为检测高倍镜的最大灰度。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0 进行统计学分析，对符合正态分布的计量资料采用t 检验和方差分析，两两比较采用SNK 检验，不符合正态分布采取秩和检验，对相关指标进行Pearson 相关性分析和直线回归分析。P＜0.05 判定差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组血清学指标检测 从表1 中可以看出单纯PCOS 组、PCOS 合并IR 组和对照组FSH、FPG 相比差异无统计学意义(P ＞0.05);PCOS 大鼠无论是否合并IR LH、T、Flns 及HOMA-IR 明显高于对照组，相比差异有统计学意义(P＜0.05)，而PCOS 合并IR 组T、Flns 及HOMA-IR 较对照组明显升高，相比差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 三组血清AMH、卵巢局部AMH 及胰岛素受体表达、单卵泡AMH 及胰岛素受体表达比较 从表2中可以看出PCOS 大鼠无论是否合并IR 血清AMH、卵巢局部AMH 均高于对照组，相比差异有统计学意义(P＜0.05);PCOS 合并IR 组明显高于单纯PCOS 组，相比差异有统计学意义(P＜0.05);三组间卵巢局部胰岛素受体、单卵泡AMH 及单卵泡胰岛素受体相比差异无统计学意义(P ＞0.05)。

2.3 AMH 与胰岛素、胰岛素受体表达相关性分析 经过Pearson 相关性分析结果显示血清AMH 表达强度与胰岛素表达强度无明显相关性(r=0.015，P ＞0.05);卵巢局部AMH 表达与胰岛素受体有明显相关性(r=0.671，P=0.003);单卵泡AMH 表达强度与胰岛素受体表达强度无明显相关性(r=0.011，P ＞0.05);而对血清AMH 的表达与HOMA-IR 进行Pearson相关性分析结果显示HOMA-IR 与血清AMH 之间存在明显的正相关性(r=0.683，P=0.001)。

表1 三组血清学指标比较Tab.1 Compares three groups of serological markers

表2 三组空腹胰岛素、卵巢局部AMH 及胰岛素受体表达、单卵泡AMH 及胰岛素受体表达比较Tab.2 Three fasting insulin，insulin receptor expression in local AMH and ovarian follicle single AMH and insulin receptor expression in comparison

2.4 血清AMH 与HOMA-IR、血清T 及胰岛素多元回归分析 经过逐步回归筛选，血清T 不符合回归方程，变量HOMA-IR 和胰岛素符合回归方程，经方差分析，F=12.37，P=0.000 1，因此血清AMH与HOMA 指数和血清胰岛素之间可能存在直线关系，将其代入多元回归方程AMH=15.676 HOMAIR+4.683 FINS -72.112，两变量的偏回归系数分别为15.661 和4.682，因此，HOMA-IR 对血清AMH的影响与胰岛素相比无明显统计学意义(P ＞0.05)。

3 讨论

PCOS 是育龄期妇女常见的一种疾病，主要特征为排卵障碍、高雄激素血症、胰岛素抵抗及卵巢多囊性改变，发病率为5%～10%，但发病原因及机理目前尚不明确。AMH 是转化生长因子超家族中的一员，是一种二聚体糖蛋白，高表达于卵巢窦前卵泡和小窦状卵泡上，女性开始青春期发育时，AMH 的表达水平已经开始逐步上升，最终到达基础水平，该水平维持整个生育期。PCOS 的诊断标准中无AMH的相关说明，但从众多的研究中发现AMH 在PCOS的代谢功能紊乱及相关远期并发症的发生发展中有不可忽视的作用。有学者研究认为PCOS 患者AMH 水平较正常女性高2～3 倍［3］。

本研究结果显示PCOS 大鼠无论是否合并IR LH、T、Flns 及HOMA-IR 明显高于对照组，相比差异有统计学意义(P＜0.05)，而PCOS 合并IR 组T、Flns 及HOMA-IR 较对照组明显升高，相比差异亦有统计学意义(P＜0.05)。

PCOS 大鼠血清AMH 升高可能是导致排卵障碍的原因之一，可能机理是与正常卵巢相比PCOS卵巢存在较多的停滞不前的窦前卵泡，因此，AMH分泌增多，导致卵泡发育及排卵障碍，进而导致更多的不成熟卵泡，AMH 分泌也逐渐增多。有学者研究表明PCOS 患者血清中AMH 表达水平与雄激素和胰岛素水平呈正相关［4］。本研究结果显示:PCOS大鼠无论是否合并IR LH、T、Flns 及HOMA-IR 明显高于对照组，相比差异有统计学意义(P＜0.05)，表现为代偿性胰岛素升高(CHI)，而空腹血糖无显著差异。有学者研究显示胰岛素升高能够促进卵泡募集［5］，卵泡募集导致小窦卵泡和窦前卵泡增多，进而增加AMH 分泌，而AMH 具有抑制颗粒细胞芳香化酶的作用，进而降低卵泡对FSH 的敏感性，雄激素的合成增加，最终导致小窦卵泡数目增多，AMH的产生相应也增多。上述结果说明:AMH 和胰岛素相互作用可能是导致PCOS 患者雄激素升高的原因，三者之间可能具有相互作用、相互影响的关系。

目前对于PCOS 患者单个卵泡AMH 水平各个学者无统一的标准，有学者研究表明PCOS 患者单个卵泡AMH 会显著升高［1］，另有学者认为AMH 的水平只是与小卵泡的数量有关，而单个卵泡分泌AMH 的水平无明显改变［6］。从临床治疗的结果上也可以看出，采用胰岛素增敏剂治疗PCOS 患者，可以有效降低高胰岛素血症，减少窦前卵泡的数量，从而改善胰岛素抵抗［7］，而长期的二甲双胍治疗是否能够降低AMH 水平还有待于进一步观察［8］。本研究结果显示，PCOS SD 大鼠单个卵泡AMH 表达水平与正常大鼠AMH 表达相比差异不明显。可能是由于在卵泡早期，雄激素的水平升高，导致多个小卵泡生长，卵泡的数量增加，但单个卵泡表达的AMH 水平无变化，但是随着小卵泡数量的不断增多，卵巢局部AMH 水平表达增多，胰岛素受体也增多［9］。

胰岛素受体在卵泡细胞膜表面及间质均有表达，对卵巢功能发挥着重要的调节作用。当机体出现胰岛素抵抗时，胰岛素代谢紊乱［10］。早期认为PCOS 代偿性高胰岛素将降调节胰岛素受体数目，胰岛素抵抗可能是由于胰岛素受体数目减少引起。本研究结果显示，PCOS 大鼠与对照组相比，卵巢局部和单卵泡胰岛素受体表达无差异，单卵泡AMH水平与胰岛素受体表达无相关性，卵巢局部AMH表达与胰岛素受体呈明显相关性，因此，可以推测PCOS 卵巢局部AMH 的高表达可能与高胰岛素血症具有相关性，在AMH 与胰岛素受体的相互作用下雄激素向雌激素的转化受到阻滞，与高雄激素血症之间形成正反馈调节作用［1］。

总之，PCOS 大鼠AMH 与血清胰岛素水平呈正相关，卵巢局部AMH 表达与胰岛素受体有正相关性，而单卵泡AMH 表达与胰岛素受体无明显相关性，对于是否与高雄激素有关，还需要进一步研究。

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