Plk1、Chk1/2 在原发性肝癌组织及HepG2 细胞中的表达研究①

杨大刚 王 众 王惠群 孙诚谊 (贵阳医学院附属医院肝胆外科，贵阳 550004)

Plk1 是一种高度保守的丝/苏氨酸蛋白激酶，有诱导DNA 合成、DNA 完整性的检修及防止细胞凋亡的作用。Plk1 与中心体复制，纺锤体形成，染色体分离以及胞质分裂等有丝分裂期过程密切相关。当细胞周期检测点启动时，Plk1 通过降解细胞周期抑制蛋白weel，促使细胞进入新的细胞周期。当Plk1 突变或受外源性刺激干预后会失去其在有丝分裂期的正常功能并可以诱发细胞分裂紊乱，促使细胞发生癌变。此外，Plk1 可以通过抑制人线粒体抗病毒信号蛋白(Mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS)，调节具有抗病毒、抗肿瘤功能的IFN(Interferon，IFN)的生成，破坏先天性免疫［1］，降低机体对肿瘤的抵抗作用。

细胞周期检测点激酶1、2(Check point kinase 1/2，Chk1/2)作为细胞周期检测中关键的效应蛋白激酶，主要以S 期和G2/M 期为主要调控点，调控细胞周期的正常时序。当Chk1/2 表达异常时，引起基因组稳定性下降、导致肿瘤发生，因此细胞周期检测点与肿瘤细胞逃避凋亡的机制密切相关［2］。相对应的，当肿瘤细胞受到放化疗杀伤，DNA 复制紊乱时，Chk1/2 也会帮助肿瘤细胞停止细胞周期进程并修复损伤，使其逃避放化疗的杀伤。本研究通过了解Plk1、Chk1/2 在原发性肝癌组织及HepG2 细胞中的表达，以期为原发性肝癌的生物免疫治疗治提供依据。

1 材料与试剂

1.1 材料

1.1.1 组织来源 以手术切除并排除术前放、化疗的病例资料完整的原发性肝癌石蜡标本40 例。其中17 例为高、中分化，23 例为低分化;年龄:34～71岁，中位年龄48 岁。同时分别随机选取正常肝组织及肝硬化组织标本各8 例，该16 例组织标本经病理诊断排除肿瘤病变，所有组织标本均由贵阳医学院附属医院病理科提供。

1.1.2 主要试剂 鼠抗人Plk1 单克隆抗体、鼠抗人Chk1 单克隆抗体、鼠抗人Chk2 单克隆抗体及鼠单克隆β-actin 抗体均为美国Santa Cruz 公司生产。二步法免疫组化检测试剂盒及DAB 显色剂购自北京中杉金桥生物技术公司产品。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化检测蛋白表达 采用Envision 免疫组化二步法染色，具体步骤按试剂盒说明操作。将石蜡包埋组织4 μm 厚切片，常规二甲苯梯度脱蜡，酒精梯度脱水，高压抗原修复，以PBS 替代一抗作阴性对照，已知阳性切片作为阳性对照。

1.2.2 结果判断 采用双盲法阅片，在光镜下进行形态学观察，阳性细胞指细胞核和细胞浆含浅灰色或者灰色、深灰色颗粒者;阳性率指高倍镜(×400)下计数5 个视野内100 个细胞的平均阳性细胞率;蛋白表达的由弱至强依次为:黑色0 分、浅灰色1分、灰色2 分、(棕)深灰色3 分;平均阳性率＜10%计0 分，10%～24% 计1 分，25%～49%计2 分，50%～74%计3 分，≥75%计4 分。综合判定:取着色强度和阳性率分数之乘积:0 分记为(-)，1～2分记为(+)，3～4 分记为(++)，6～8 分记为(+++)，9～12分记为(++++);(-)和(+)判定为表达阴性，(++)～(++++)判定为阳性表达。

1.2.3 Plk1、Chk1/2 蛋白在HepG2 细胞中表达的定性分析 采用Western blot 方法对Plk1、Chk1/2蛋白在HepG2 细胞中表达进行定性分析，以β-actin作为内参蛋白。应用Photoshop cs5.0 软件测定每条条带的平均灰度值和面积，并用平均灰度值减去背景灰度值所得的绝对灰度值×蛋白条带所占面积作为目标条带的最终灰度值。以目标蛋白和β-actin 蛋白最终灰度值相比所得的相对表达率为数据，检验不同基因蛋白表达的差异。

1.3 数据统计分析 采用SPSS19.00 进行数据处理分析，检验水准α=0.05。免疫组化结果采用χ2检验，蛋白表达灰度值采用多组单因素方差分析。

2 结果

2.1 Plk1、Chk1/2 蛋白的表达 如表1 及图1 所示:40 例原发性肝癌组织中，Plk1、Chk1/2 的阳性例数分别为23 例、30 例和9 例，阳性表达率分别为57.5%、75.0% 和22.5%。16 例肝非肿瘤组织中Plk1、Chk1/2 的阳性分别为0 例、4 例和9 例，分别占总例数的0%，25.0%和56.3%。原发性肝癌组织中Plk1 和Chk1 表达阳性率均高于肝非肿瘤组织(P＜0.05)。而Chk2 在肝非肿瘤组织的表达高于在原发性肝癌组织中的表达(P＜0.05)。

2.2 HepG2 细胞中Plk1、Chk1/2 蛋白表达情况。

2.2.1 Plk1、Chk1/2 蛋白在HepG2 细胞中的表达如图2 所示，三种激酶蛋白在HepG2 细胞中均有表达。

2.2.2 Plk1、Chk1/2 蛋白在HepG2 细胞中表达的半定量分析 如表2 所示，激活CDC25 磷脂酶，使细胞进入M期，启动有丝分裂［3，4］。其缺失可能导致出现多中心体、多核细胞，发生姐妹染色体分离障碍等与肿瘤的发生、发展密切相关的改变［5］。

表1 Plk1、Chk1/2 在原发性肝癌和肝非肿瘤组织中表达情况［n(%)］Tab.1 Expression of Plk1，Chk1/2 in primary liver cancer(PLC)and non-tumor liver tissue(NTL)［n(%)］

图1 Plk1、Chk1/2 蛋白在原发性肝癌组织中的表达(SP，×400)Fig.1 Expression of Plk1，Chk1/2 protein in primary liver cancer tissue(SP×400)

图2 HepG2 细胞中Plk1、Chk1/2 蛋白的表达Fig.2 Plk1，Chk1/2 proteins expression in HepG2 cells

表2 Plk1、Chk1/2 蛋白与β-actin 总灰度值比较及各基因蛋白相对表达量(±s)Tab.2 Comparation of total grey value of Plk1，Chk1/2 protein and beta actin，relative expression of each protein(±s)

表2 Plk1、Chk1/2 蛋白与β-actin 总灰度值比较及各基因蛋白相对表达量(±s)Tab.2 Comparation of total grey value of Plk1，Chk1/2 protein and beta actin，relative expression of each protein(±s)

Note:Relative expression=grey value of the protein/grey value of β-actin.1)P＜0.05 compared with Plk1;2)P＜0.01 compared with Chk1，Plk1.

Chk1/2 位于细胞周期检测点激活途径的末端，DNA 受到损伤时，Chk1/2 通过调控weel、14-3-3、CDC25 等相关蛋白，激活DNA 损伤检测点，使细胞周期发生改变，滞留于G1/S、S 或G2/M 期，使受损DNA 自我修复［6］。

肿瘤细胞DNA 被破坏时，Chk1/2 可使其细胞周期暂停从而完成自我修复后逃避凋亡［7］。以Chk1/2 为作用靶点，可干扰肿瘤细胞的DNA 损伤修复机制，从而提高肿瘤治疗的敏感性［8，9］。

3 讨论

本研究结果显示:Plk1、Chk1/2 激酶蛋白在原发性肝癌组织中均有表达，Plk1、Chk1 在原发性肝癌组织中的表达高于非肿瘤组织，而Chk2 在非肿瘤组织中的表达高于原发性肝癌组织，且差异均有统计学意义。Plk1 的表达和以往所报道的其在大多数人类恶性实体肿瘤中均有表达，并与某些肿瘤的生物学行为及预后相一致［10，11］。近些年也有国内外研究表明Chk1 在一些恶性肿瘤中表达［11，12］。结合本实验结果可以说明Plk1 与Chk1 具有相对意义的肿瘤选择性表达，且Plk1 在原发性肝癌组织中的表达率为57.5%，而在所有的非肿瘤组织中均无表达;Chk1 在原发性肝癌组织中的表达率为75.0%，说明Plk1 与Chk1 可能是未来原发性肝癌治疗的理想靶点。

Plkl、Chk1/2 蛋白在HepG2 细胞中均有表达，其表达强度为Plk1 ＞Chk1 ＞Chk2。这一点验证了这三种基因在原发性肝癌治疗中Plk1 及Chk1 作为靶点的特异性。HepG2 为人肝癌细胞，生长增殖旺盛，故其多处于M 期，而Plk1 激酶正发挥着细胞从分裂间期进入分裂期的“分子开关”作用。Chk1/2激酶作用于细胞分裂间期，故他们在HepG2 细胞中的表达水平低于Plk1，而Chk2 的表达最低，但明确其与肿瘤发生之间的相互关系尚需进一步研究。

Chk1 在细胞周期中的作用位置与Plk1 互补，几乎作用于除M 期之外的G1 期、S 期、G2 期;Chk2则作用在G1 期与G2 期。考虑到本实验所研究的HepG2 细胞为人肝肿瘤细胞，处于对数生长期时分裂增殖数率很快，故其处于M 期的细胞数量较多，因此Plk1 在三种蛋白中的表达丰度最高。而Chk1是细胞处于细胞间期准备阶段的重要蛋白，可以说在细胞间期发挥着许多决定性作用，为肿瘤细胞的分裂增殖提供了生物学保证。本研究结果显示Chk2 在肝非肿瘤组织中的表达率高于原发性肝癌组织，说明Chk2 可能参与了原发性肝癌的发生与发展过程，但其并非是关键蛋白，其与原发性肝癌发生、发展的关系尚待探索。

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