金凤颗粒对痛风性关节炎兔关节软骨MMP-1/TIMP-1 表达影响①

王晓倩 李 鑫 郭建生 朱克俭

(湖南中医药大学中药现代化研究湖南省高校重点实验室，长沙 410208)

痛风性关节炎(Gouty arthritis，GA)是一种由于体内嘌呤代谢异常，使尿酸钠在关节腔内沉积形成结晶，造成关节肿胀、变形的结晶性关节炎［1］。随着居民大量的摄食蛋白质及富含嘌呤成分的食物，痛风已成为影响我国人口健康的重大代谢性疾病之一，引起国内外医学界的高度关切［2］。

研究认为，痛风发病机制主要为血液中尿酸含量升高，达到饱和状态形成尿酸钠微结晶。当关节腔内的尿酸盐结晶被白细胞吞噬后，沉积并刺激关节滑膜、软骨及关节周围组织，释放出组胺、趋化因子及相关前炎症因子等物质，使调节炎症反应的基质金属蛋白酶-1(Matrix metalloproteinases，MMP-1)高表达，导致MMP-1/TIMP-1(Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMP-1，组织金属蛋白酶抑制剂-1)失衡，关节软骨发生病理性改变［3］，导致局部血管扩张、白细胞大量聚集，大量炎性细胞浸润［4］，形成痛风性关节炎［5］。

目前临床治疗痛风以缓解症状为主，多使用秋水仙碱、吲哚美辛等非甾体类化学药品。然而上述药物的使用并不能延缓病情发展，且存在腹泻、血小板减少等副作用。中医学认为，痛风以脾、肾亏虚为本，痰瘀、湿热为标，痰瘀为病之变，湿热为病之现［6］。中医药治疗痛风不仅疗效确切，且安全性高。本课题组拟研发治疗痛风性关节炎的创新中药——金凤颗粒，该药由萆薢、凤尾草、艾叶、金钱草等组成。前期研究显示，金凤颗粒能显著降低氧嗪酸钾盐所致高尿酸血症小鼠的尿酸水平［7］，能有效抑制TNF-α、IL-8、IFN-γ 等促炎性因子释放［8］。本研究拟建立痛风性关节炎实验兔模型，研究金凤颗粒对关节病理损伤及关节软骨MMP-1/TIMP-1 的影响，进而明确其治疗痛风性关节炎的作用机制，为其临床治疗痛风性关节炎提供科学实证依据。

在开展本实验研究工作前均签署动物实验伦理审查书，且所有工作的进行均符合动物实验相关条件及动物实验伦理审查委员会的相关要求及所有规定。

1 材料与方法

1.1 试药及试剂

1.1.1 受试药物 金凤颗粒(No.140301)，湖南省中医药研究院;腺嘌呤(No.0183)，英国Amresco 公司;尿酸钠(No.U2875)，美国Sigma 公司;盐酸乙胺丁醇片(No.1304041)，沈阳红旗制药有限公司;别嘌醇片(No.20140108)，广东彼迪药业有限公司;痛风定胶囊(No.1405112)，四川升和药业股份有限公司。

1.1.2 试剂 兔抗人MMP-1(No.BA0568)、TIMP-1(No.BA0575)多克隆抗体，SABC 免疫组化染色试剂盒(No.SA1022)，DAB 显色试剂盒(No.AR10 22)，武汉博士德生物工程有限公司;甲醛溶液(No.20140204)，天津市百世化工有限公司。

1.1.3 实验动物 新西兰家兔，雄性，体重1.5～2 kg，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，合格证编号:SCXK(湘)2011-0003。

1.2 方法

1.2.1 痛风性关节炎家兔模型建立［9］取新西兰家兔70 只，按体重进行随机化分组，分为空白组(10只)和模型组(60 只)。模型组灌服腺嘌呤(200 mg/kg)和乙胺丁醇(250 mg/kg)，1 次/d，连续7 d。末次给药后30 min，将10%MSU 混悬液经上髌骨韧带(关节伸直45°，4 号针头进针，插入胫骨肌腱内侧)注射入兔右踝关节关节腔，0.3 ml/只，复制痛风性关节炎模型。

1.2.2 分组及给药 模型成功后，按体重进行随机化分组，分为模型组、金凤颗粒高、中、低剂量组(19.6、9.8、4.9 g/kg)、别嘌醇组(0.028 g/kg)及痛风定组(0.448 g/kg)。各组分别给予相应药液，模型组、空白组给予等容积蒸馏水，ig 给药，8 ml/kg，1次/d，连续7 d。

1.2.3 金凤颗粒对痛风性关节炎家兔关节软骨组织病理形态学改变的影响 末次给药24 h 后，麻醉家兔，取关节软骨组织，10 %甲醛溶液固定，将软骨病理标本做成蜡块，间断连续切片，切片厚约5 μm，HE 染色，采用盲法实验原则，选用未知分组人员观察其病理形态学的改变，并评分，评分标准见表1［10］。

1.2.4 金凤颗粒对痛风性关节炎家兔关节软骨中MMP-1、TIMP-1 表达的影响 末次给药2 h 后，麻醉家兔，取关节软骨组织，于10%甲醛溶液固定，行免疫细胞化学检测。严格按照试剂盒说明操作，采用免疫细胞化学SP(链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物)法检测。每张切片选取5 个典型区域拍摄数码图像，使用图像分析软件分析各组照片的单位光密度值并进行比较，根据光密度值的大小判断各指标表达水平。

1.3 统计学处理 实验数据用SPSS18.0 软件分析，数据用±s 表示。组间比较，计量资料首先做正态性和方差齐性检验，满足方差齐性，采用Oneway ANOVA 进行方差分析，不满足方差齐性采用非参数法检验。P＜0.05，差异有统计学意义，P＜0.01差异有高度统计学意义。

表1 关节软骨组织学改变的组织学分级评分标准Tab.1 Histological classification criteria of synovial histologic change

2 结果

2.1 金凤颗粒对家兔关节软骨组织病理变化的影响 空白组关节软骨面完整，未见有血管充血、黏膜肿胀、炎细胞浸润及组织坏死，也未见有绒毛状增生和血管翳形成。模型组家兔关节软骨组织形态紊乱，有血管充血及大量炎性细胞浸润，部分样本关节软骨组织坏死，与空白组比较，评分有显著性差异(P＜0.01)，提示模型复制成功。经金凤颗粒治疗后，各剂量组家兔关节软骨组织血管充血、黏膜肿胀、炎细胞浸润、组织坏死情况均有显著的改善，差异具有显著性(P＜0.05 或P＜0.01)。结果见表2 及图1。

2.2 金凤颗粒对家兔软骨组织MMP-1、TIMP-1 表达影响 与空白组相比，模型组家兔关节软骨组织MMP-1 表达水平显著升高(P＜0.01)、TIMP-1 表达显著降低(P＜0.01)，提示模型建立成功。经金凤颗粒治疗后，与模型组相比，高剂量组MMP-1 表达显著降低(P＜0.05)，TIMP-1 表达增强(P＜0.01)。中剂量组MMP-1 的表达降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。结果见表3，图2、3。

表2 关节软骨改变的组织学分级评分结果(±s，n=10)Tab.2 Results of grading histological change of articular cartilage tissue(±s，n=10)

表2 关节软骨改变的组织学分级评分结果(±s，n=10)Tab.2 Results of grading histological change of articular cartilage tissue(±s，n=10)

Note:1)P＜0.01 as compared to the normal subject;2)P＜0.05，3)P＜0.01 as compared to the model subject.

表3 金凤颗粒对家兔关节软骨组织MMP-1、TIMP-1 及MMP-1/TIMP-1 影响(±s，n=10)Tab.3 Effect of Jinfeng granules on MMP-1，TIMP-1 and MMP-1/TIMP-1 in rabbit articular cartilage(±s，n=10)

表3 金凤颗粒对家兔关节软骨组织MMP-1、TIMP-1 及MMP-1/TIMP-1 影响(±s，n=10)Tab.3 Effect of Jinfeng granules on MMP-1，TIMP-1 and MMP-1/TIMP-1 in rabbit articular cartilage(±s，n=10)

Note:1)P＜0.01 as compared to the normal subject;2)P＜0.05，3)P＜0.01 as compared to the model subject.

图1 金凤颗粒对家兔关节软骨组织病理形态学影响(×400)Fig.1 Effect of Jinfeng granule on pathomorpholoy of rabbit articular cartilage tissue(×400)

图2 金凤颗粒对家兔关节软骨组织MMP-1 表达的影响(×400)Fig.2 Effect of Jinfeng granule on expression of MMP-1 in rabbit articular cartilage tissue(×400)

图3 金凤颗粒对家兔关节软骨组织TIMP-1 表达的影响(×400)Fig.3 Effect of Jinfeng granule on expression of TIMP-1 in rabbit articular cartilage tissue(×400)

3 讨论

MMP-1 是细胞外基质降解最重要的蛋白系统，参与了痛风性关节炎关节组织创伤修复与重塑、炎症反应等过程［11］。TIMP-1 是MMP-1 的天然拮抗剂，与活化的MMP-1 结合形成复合物，从而阻断MMP-1 活性，维系MMP-1/TIMP-1 平衡［12］。有学者研究提示，MMP-1 活化浓度与关节炎症密切相关，MMP-1/TIMP-1 失衡可能是痛风性炎症病程中难以愈合的重要因素之一［13］。

本研究发现，模型组家兔关节软骨组织排列紊乱，血管充血及大量炎性细胞浸润，部分样本关节软骨组织坏死，关节软骨组织中MMP-1 显著升高(P＜0.01)、TIMP-1 显著下降(P＜0.01)，MMP-1/TIMP-1 失衡(P＜0.01)。提示机体受到MSU 晶体刺激后，MMP-1 表达增强，TIMP-1 不同程度的丢失或低表达，导致MMP-1/TIMP-1 失衡，对细胞外基质的降解能力增强，激活炎症瀑布反应而出现关节软骨组织严重充血、大量炎性细胞浸润、明显肿胀、坏死，而导致关节软骨严重受损。

经金凤颗粒治疗后，高剂量组MMP-1 得到明显抑制(P＜0.01)，TIMP-1 表达明显加强(P＜0.05)，MMP-1/TIMP-1 显著降低(P＜0.01);中剂量组MMP-1 有统计学差异(P＜0.05)，MMP-1/TIMP-1趋向平衡(P＜0.05);病理形态学改变也得到明显改善(P＜0.05 或P＜0.01)。研究结果提示，金凤颗粒的作用机制可能与通过抑制MMP-1 高表达，加强TIMP-1 表达，调节MMP-1/TIMP-1 平衡，阻断炎症反应循环链，而实现其临床疗效。

综上，金凤颗粒能有效抑制痛风性关节炎的病理损害，其作用机制可能是与通过阻断MMP-1 活性，恢复MMP-1/TIMP-1 失衡有关。

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