免疫治疗不明原因反复自然流产患者群体反应抗体、TGF-β 和nTreg表达变化的研究

任兴斌 张 伟 (临沂市人民医院检验科，临沂 276003)

反复自然流产是妊娠常见并发症之一，发病率高，病因及发病机制复杂，排除血型不合、解剖、内分泌、感染等因素后，有40%～60%的患者原因不明，近年来研究发现，不明原因反复自然流产(Unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)与患者体内心磷脂抗体等自身抗体的升高、母胎免疫识别的低下和过度等所形成的免疫功能紊乱有关［1，2］，且有研究表明维持机体免疫平衡的转录调节因子3阳性的天然调节性T 细胞(nTreg，CD4+CD25+FOXP3+)在URSA 患者外周血及蜕膜组织中的表达显著低于健康妊娠孕妇［3］。近年来，在知情同意的原则下应用患者配偶单个核细胞对具有适应症的URSA 患者进行免疫治疗成为为患者重建母胎免疫平衡从而达到成功妊娠目的的重要治疗手段并得到广泛应用，但治疗后的效果评估指标和成功与否的成因机制尚需进一步探讨。为此，笔者分别检测了正常生育者、URSA 患者免疫治疗后未孕者和成功妊娠者血清群体反应抗体(PRA)、转化生长因子β(TGF-β)水平及外周血单个核细胞nTreg 表达率并作比较分析，探讨其在免疫治疗中的临床意义，报道如下:

1 资料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 URSA 免疫治疗组 随机选取2011 年2 月至2013 年6 月间在我院做相关检查并进行免疫治疗的原发性URSA 患者，其磷脂抗体、血型抗体、精子抗体等自身抗体均为阴性，排除解剖、内分泌、染色体、感染等因素，男方精子各项参数正常。入组时经1 个周期2 个疗程的免疫治疗，经免疫治疗后未孕组28 例(28～34 岁)，成功妊娠组32 例(27～32岁)。

1.1.2 正常妊娠组 26 例(26～32 岁)，正常妊娠4～6 个月，男女双方均无内分泌及免疫性疾患史，接受免疫学检查时处于正常妊娠状态。

1.2 免疫治疗方法 采取患者配偶肝素抗凝静脉血40～50 ml，常规分离单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，经患者上肢皮内6 点注射免疫疗法，间隔3 周免疫1 次，3 次为1 疗程，第一疗程结束2 周后，安排受孕，并继续第二疗程的治疗，至第二疗程结束后检测本研究的各项指标。

1.3 样本的采集与处理 采取URSA 患者或正常妊娠组女性待检者全血4 ml，分装2 管，1 管肝素抗凝常规分离PBMC，调细胞浓度至1 ×107ml-1，用于检测nTreg。另1 管自凝，1 h 内分离出血清，超低温冰箱保存，用于PRA 抗体、TGF-β 检测。

1.4 仪器、试剂与检测方法

1.4.1 仪器、试剂 采用Beckman-Coulter 公司的EPICS-XL4 型流式细胞仪检测上述处理后单个核细胞的nTreg 表达率。Human T Regulatory T cell staining kit(其中含有抗人CD4-FITC 抗体、抗人CD25-PE 抗体、抗人FOXP3-PE-Cy5 抗体以及配套的固定和透膜试剂)，购自eBioscience 公司，TGF-β 定量ELISA 试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司。主要设备为三洋超低温冰箱、BioTek-ELX800 酶标仪、Beckman-Coulter公司EPICS-XL4型流式细胞仪等。

1.4.2 检测方法

1.4.2.1 PRA 的测定 采用美国oneLamhda 公司的莱姆德抗原板(LAT1240)酶联免疫吸附分析法(ELIASA)，严格按试剂盒操作说明书操作。莱姆德抗原Terasaki 微孔板每人份40 孔，包被有21 种HLA-A 抗原，44 种HLA-B 抗原，15 种HLA-Cw 抗原和18 种HLA-DR 抗原、7 种HLA-DQ 抗原、23 种HLA-DP 抗原，可同时检测血清中的HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ类抗体。结果判断:PRA 总阳性率(%)=(阳性反应数÷40)×100%。

1.4.2.2 Human TGF-β 检测按试剂盒说明书操作，集中检测。

1.4.2.3 nTreg 检测 常规分离PBMC，取细胞悬液100 μl 分别加10 μl CD4-FITC 和CD25-PE 后，孵育30 min，PBS 洗1 次，再加入1 ml 经过稀释的固定、透膜剂，反应40 min 后以透膜缓冲液洗涤并重悬，再加入15 μl PE-Cy5 标记FOXP3 抗体(同时设同型对照反应管)，反应30 min 后洗涤，以500 μl PBS 重悬，采用Beckman-Coulter 公司EPICS-XL4 型流式细胞仪，在FSC-SSC 散点图上选定淋巴细胞群，以CD4 和SSC 设门，选择CD4+细胞，分析CD25+FOXP3+细胞所占比例。

1.5 统计学分析 采用SPSS22.0 软件进行统计学分析，病例资料呈非正态分布，以Kruskal-Wallis法检验，P＜0.05 为差异有统计学意义，组间两两比较采用Bonferroni 法，P＜0.01 为差异有统计学意义。

2 结果

正常妊娠妇女血清PRA 阳性率中位数为7.5%;TGF-β 含量中位数为:190.65 pg/L;nTreg 表达率中位数为:11.35%。经免疫治疗后URSA 患者未孕组、妊娠组PRA 阳性率中位数分别为:27.5%、68.75%(P＜0.01);TGF-β含量中位数分别为:107.7 pg/L、189.4 pg/L(P＜0.01);nTreg 表达率中位数分别为:5.05%、8.05%(P＜0.01)。免疫治疗后URSA 未孕组患者在血清PRA 阳性率、TGFβ 含量及nTreg 表达率中位数均低于免疫治疗后妊娠组患者。除正常妊娠组与USRA 治疗后妊娠组在血清TGF-β 含量无统计学差异外，其余各组间两两比较均有统计学差异，结果见表1、2。

表1 正常妊娠组、URSA 患者免疫治疗后未孕组及妊娠组血清PRA、TGF-β 和nTreg 的比较Tab.1 Comparison of PRA，TGF-β and nTreg among normal pregnancy group，unpregnancy group after immunotherapy and pregnancy group after immunotherapy

表2 正常妊娠组、URSA 患者免疫治疗后未孕组及妊娠组血清PRA、TGF-β 和nTreg 的两两比较Tab.2 Paired-comparisons of PRA，TGF-β and nTreg among normal pregnancy group，unpregnancy group after immunotherapy and pregnancy group after immunotherapy

3 讨论

生殖免疫学研究认为妊娠是一种同种半异体移植现象，胚胎可看作是具有父系和母系各50% 遗传物质的同种移植物。妊娠中胎儿作为一种同种半异体抗原不被母体排斥反而产生保护性免疫应答有赖于母体对胎儿的半同种异体移植免疫耐受。群体反应性抗体(Panel reactive antibodies，PRA)是指患者血清内的抗人类白细胞抗原(HLA)的抗体，该抗体主要出现在输血、生育、组织及器官移植等人群中。人类白细胞抗原(HLA)是由位于人类第6 号染色体短臂上有224 个基因座的人类白细胞抗原复合体(HLA 复合体)编码产生的主要表达在细胞膜表面的一组蛋白，担负着控制细胞间相互识别、抗原处理和提呈、参与T 细胞分化、诱导和调节免疫应答等生物学作用和功能。李立新等［4］大量前期的免疫治疗结果报道显示:夫妇间HLA 抗原的相容程度与URSA 有关、在正常妊娠中父系HLA 抗原刺激母体产生称为封闭抗体的相应抗体并与胚胎滋养细胞的HLA 抗原形成复合物，保护胎盘免受母体免疫细胞的损伤。免疫治疗过程中分离的URSA 患者配偶的PBMC 包括了富含HLA-Ⅰ抗原的淋巴细胞、血小板及表达HLA-Ⅱ类抗原的单核细胞等抗原提呈细胞，其配偶PBMC 中HLA 抗原成分及免疫源特性和URSA 患者的反应性不同，产生相应抗体的几率和数量会有差异。LAT1240PRA 检测试剂中具备能检测HLA-Ⅰ类抗原和HLA-Ⅱ类抗原亚型抗体的检测能力，能较全面地反映URSA 患者经免疫治疗后封闭抗体的产生状态，因URSA 患者的个体状态及其对配偶HLA 抗原相容度的差异，相应抗体的产生种类和数量及对自身免疫系统的影响也会不同，从而影响个体的免疫再平衡状态。本研究PRA 检测结果显示:URSA 患者经免疫治疗后妊娠组血清PRA阳性率较免疫治疗后未孕组明显提高(P＜0.01)，提示URSA 患者经过其配偶PBMC 免疫治疗后，在提升URSA 患者自身免疫耐受和免疫抑制功能的同时，产生的针对其配偶HLA 抗原的封闭抗体，抑制了URSA 患者对其胚胎父系抗原的处理和提呈，下调了免疫应答强度，对克服URSA 及后续的成功妊娠起到了首要作用。

URSA 患者母胎免疫耐受的失衡及流产的发生，与激活患者体内T 细胞的免疫应答相关，而调节性T 细胞在维持免疫应答平衡发挥着重要作用，按表面标记分类，调节性T 细胞可分为CD4+和CD8+两大类。CD4+调节性T 细胞又可分为天然型调节性T 细胞(nTreg，CD4+CD25+FOXP3+)和诱导型调节性T 细胞Tr1 和Th3，Th3 调节性T 细胞主要通过分泌TGF-β 发挥免疫调节作用［5］。

TGF-β 是一种重要的内源性免疫抑制因子，通过自分泌或者旁分泌的形式抑制免疫效应细胞的增殖、分化和活化，抑制抗原提呈细胞表面HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ类分子表达，抑制NK 活性以及抑制细胞因子产生如抑制PBMC 中IFN-γ、TNF-α 的产生和IL-2等促炎性细胞因子的功能，促进B 细胞分泌Ig 类型转换为IgA 和IgE 和促进细胞外基质(ECM)如胶原蛋白、纤黏连蛋白的表达，对细胞的形态发生、增殖和分化过程起着重要作用，有利于胚胎发育和细胞修复［6］。故TGF-β 起着以“负调节”为主的免疫平衡调节作用。本研究显示URSA 未孕组患者TGF-β水平较正常妊娠组明显降低(P＜0.01)，提示患者免疫抑制功能缺陷，使其对父系抗原的反应性增强，促使了URSA 的发生。经免疫治疗后，父系PBMC诱导URSA 患者调节性T 细胞效应分子TGF-β 的表达达上调，抑制了URSA 患者对胚胎抗原的排斥反应，缓解了URSA 患者的免疫失衡状态，使胚胎能正常着床和发育，达到URSA 患者成功妊娠的目的。而未孕组免疫治疗后TGF-β 含量较成功妊娠组明显偏低，结果差异有统计学意义(P＜0.01)，也提示部分URSA 患者TGF-β 偏低是免疫治疗后不能成功妊娠的因素之一。

具有FOXP3 特异性标志的nTreg 在胸腺中分化发育成熟后进入外周淋巴组织，主要通过细胞接触的方式，抑制Th1 细胞介导的免疫应答及B 细胞增殖，在维持机体免疫自稳、调控免疫应答方面起重要作用。本研究结果显示，治疗组URSA 患者外周血nTreg 表达率均较正常妊娠组降低，差异有统计学意义(P＜0.01)，未孕组nTreg 表达率也明显低于妊娠组(P＜0.01)。提示URSA 患者由于nTreg 细胞数量减少或功能受损，减弱了对T 细胞免疫功能的抑制作用，成为URSA 发病的主要原因，患者经免疫治疗刺激后，伴随着nTreg 细胞表达数量的增高，免疫抑制作用逐渐增强，减弱了患者对胚胎半抗原的免疫排斥反应，维持了正常的免疫平衡，达到能够成功妊娠的目的。

综上所述，本研究结果证实URSA 患者经免疫治疗后，产生的针对其配偶HLA 抗原的保护性抗体，下调了母体的免疫应答强度，降低了母体对胎儿父系抗原的递呈作用并逐渐形成耐受状态，同时患者TGF-β 及nTreg 的水平提高和表达增强协同增加了对患者免疫反应的抑制强度，达到了患者母胎免疫耐受的重新平衡而成功妊娠。PRA、TGF-β 及nTreg 的检测对及时采取合适的免疫剂量和频率进行免疫治疗，减少治疗过程中的不良反应，提高妊娠的成功率有重要意义。但针对治疗前后不同时段各类HLA 抗原亚型抗体的作用、URSA 患者的个体差异和反应性、免疫治疗的作用机制和疗效动态观测指标的筛选等问题尚需进一步扩大样本量和创新研究方法继续研究探讨。

［1］王 莉，王红武，刘郁明，等.反复自然流产和不孕症血清ACA、TA、ZP 抗体检测分析［J］.中国妇幼保健，2007，22(5):624-625.

［2］林其德.原因不明复发性流产的基础与临床研究进展［J］.中华妇产科杂志，2003，38(8):481-483.

［3］Mei S，Tan J，Chen H，et al.Changes of CD4+CD25highregulatory T cells and FOXP3 expression in unexplained recurrent spontaneous abortion patients［J］.Fertil Steril，2010，94(6):2244-2247.

［4］李立新，罗奇志，余 平，等.湖南地区反复自然流产患者HLA-A、B 抗原分布及免疫治疗的初步报道［J］.实用预防医学，2007，14(1):28-29.

［5］Vukmanovic-Stejic M，McQuaid A，Birch KE，et al.Relative impact of CD4+CD25+regulatory T cells and tacrolimus on inhibition of T-cell proliferation in patients with atopic dermatitis［J］.Br J Dermatol，2005，153:750-757.

［6］Gorelik L，Constani S，Flavell RA.Mechanism of transforming growth factor beta-induced inhibition of T helper type 1 differentiation［J］.J ExP Med，2002，195:1499-1505.