Graves 病患者131 I、甲巯咪唑治疗前后外周血Th17 细胞及IL-17 水平的变化

郭泽华 于世鹏 班 博 (山东大学，济南 250100)

Graves 病(Graves' disease，GD)是甲状腺功能亢进症中最常见的一种，约占所有甲亢的85%，属于自身免疫性疾病，具体发病机制尚未明确。目前大量研究表明免疫因素在其发病过程中起着关键作用，以Th2 细胞介导的体液免疫占主导地位［1］。而近年研究［2］发现一类不同于Th1、Th2 细胞的CD4+T 细胞的新分支Th17 细胞，主要分泌白介素(Interleukin，IL)-17 等相关细胞因子。IL-17 作为重要的炎性介质，可与IL-6、TNF-α、IFN-γ 等细胞因子发挥协同效应，放大靶器官免疫反应并增强炎症性破坏作用［3］。Th17 细胞及其细胞因子参与多种自身免疫性疾病的发生过程，影响自身免疫性抗体产生［4］。本实验通过动态检测GD 患者治疗前后外周血中Th17 淋巴细胞比例及血清IL-17 水平，探讨Th17 细胞在GD 中的变化及其意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象131I 治疗组(131I therapy group):初诊GD 患者31 例，男性9 例，女性22 例，年龄(36.42±9.95)岁，病程(4.87±5.1)月，均采用131I治疗;甲巯咪唑(MMI)治疗组(MMI therapy group):初诊GD 患者30 例，男性8 例，女性22 例，年龄(36.10±9.67)岁，病程(5.14±3.2)月，采用甲巯咪唑治疗。以上两组年龄、性别、病程无统计学差异(P ＞0.05)。以上对象均按2007 年《中国甲状腺疾病诊治指南》［5］的Graves 病诊断标准进行筛选(浸润性突眼除外)，并除外合并其他自身免疫性或炎症性疾病、皮质类固醇或免疫抑制剂的使用者。正常对照组(Normal control group，NC group):选择同期30 名性别、年龄相匹配且无新近感染、自身免疫疾病的家族史的健康体检者。

1.2 试剂和仪器 异硫氰酸荧光素(FITC)标记的鼠抗人CD4 抗体、藻红蛋白(PE)标记的鼠抗人IL-17A 抗体及其相匹配的同型对照均购自美国BD 公司;佛波酯(PMA)和Ionomyein 购自美国Enzo Life-Sciences 公司;莫能霉素、固定剂、破膜剂购自美国eBioscience 公司;RPMI1640 培养液及胎牛血清购自Hyclone 公司;IL-17 ELISA 试剂盒购自R＆D 公司;流式细胞仪为美国BD 公司FACS CantoTM型。

1.3 方法

1.3.1 治疗方法 甲巯咪唑治疗方案:MMI 治疗组结合患者的年龄、病情、病程、甲功三项结果均给予甲巯咪唑(50～100 g/8 h)口服治疗，并根据其病程进展予适当加减治疗剂量。131I 治疗方案:131I 治疗组均自愿选择放射性131I 治疗，131I 剂量(uCi)=甲状腺重量(g)×每克甲状腺组织131I 给予剂量(uCi/g)/24 h 摄碘率(%)［6］，结合患者的年龄、病情、病程等个体情况适当加减剂量，选择4～5 mCi 放射性131I 剂一次性口服治疗。研究分别在治疗前(T0)、治疗后1 个月(T1)、3 个月(T3)进行相关指标的测定。

1.3.2 标本收集和外周血单个核细胞的分离 所有对象均于清晨空腹时采集静脉血8 ml，其中3 ml予2 500 r/min 离心5 min，取血清冻存于 -80℃，用于检测IL-17 水平;另5 ml 采用人淋巴细胞分离液(Ficoll)密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞(PBMC)，用RPMI1640 培养液(含10%胎牛血清0.1 mg/ml 链霉素和100 U/ml 青霉素)调整细胞浓度至2 ×106ml 个，用于流式细胞学检测。所有标本均在4 h 内处理。

1.3.3 Th17 细胞检测 ①淋巴细胞的刺激培养:将调整好浓度的PBMC 悬液接种于24 孔培养板，加入PMA 25 ng/ml，Ionomyein 1.25 g/ml，莫能霉素1.7 g/ml，在37℃5% CO2细胞培养箱中培养6～8 h;②细胞膜表面染色:收集细胞，加入20 μl CD4-FITC 单抗，室温避光孵育30 min PBS 洗涤;③固定破膜:加入固定剂100 μl，室温避光反应20 min，PBS洗涤，再加入破膜剂100 μl，室温避光反应20 min，PBS 洗涤;④细胞内染色:将细胞平均分为测定管和对照管，测定管中加入IL17A-PE 20 μl，对照管中加入相应的同型对照抗体，混匀后4℃避光反应30 min，PBS 洗涤2 次。上流式细胞仪检测，用CellsQuest 软件获取分析数据。

1.4 统计学处理 应用SPSS17.0 统计软件进行分析，计量资料采用±s 表示，两组间比较根据方差是否齐性采用t 或t'检验;GD 治疗前及治疗后1 个月、3 个月Th17 细胞/CD4+T 细胞、血清IL-17 水平比较采用单因素重复测量的方差分析，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 甲状腺指标比较 GD 患者治疗前(T0 组)与正常对照组相比，T0 组游离三碘甲腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)、甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)、甲状腺球蛋白抗体(TGAb)和促甲状腺素受体抗体(TRAb)阳性率显著高于正常对照组，促甲状腺激素水平(TSH)明显低于正常对照组(P ＜0.01)，131I 治疗组与MMI 治疗组相比(P ＞0.05)。见表1。

2.2 Th17 细胞、IL-17 治疗前后比较131I 治疗组、MMI 治疗组治疗前(T0)外周血Th17 细胞/CD4+T 细胞百分率及IL-17 水平，无明显统计学差异(P ＞0.05)，两组均明显高于正常对照组(P＜0.01)。治疗前后(T0、T1、T3 组)之间比较采用单因素重复测量的方差分析:131I 治疗组外周血Th17 细胞/CD4+T 细胞百分率及IL-17 水平在T0、T1、T3 组中水平逐渐下降(P ＜0.01)，F 值分别为131.350、326.206(P=0.000);MMI 治疗组变化无统计学差异(P ＞0.05)。T3 组与NC 比较(P ＜0.01)，见图1、表2。

2.3 相关性分析 采用Spearman 分析双变量相关性:外周血Th17 细胞比例与血清IL-17 水平呈正相关(r=0.758，P ＜0.05);Th17 细胞比例、IL-17 水平与GD 患者血清甲状腺相关抗体呈正相关。见表3。

表1 各组甲状腺指标比较(±s)Tab.1 Thyroid hormones and autoantibodies of different groups(±s)

表1 各组甲状腺指标比较(±s)Tab.1 Thyroid hormones and autoantibodies of different groups(±s)

Note:1)vs NC，P ＜0.01;2)131I therapy group vs MMI therapy group，P ＞0.05.

图1 Th17 细胞流式细胞仪散点图Fig.1 Typical dot plots of flow cytometric analysis of Th17 cells

表2 治疗前后各组Th17 细胞、IL-17 的比较(±s)Tab.2 Comparison of mean values of Th17，IL-17 among T0，T1，T3 and NC group (±s)

表2 治疗前后各组Th17 细胞、IL-17 的比较(±s)Tab.2 Comparison of mean values of Th17，IL-17 among T0，T1，T3 and NC group (±s)

Note:1)T0，T1，T3general linear model-repeated measures in 131I therapy group，P ＜0.01;2)T0，T3 vs NC t-test，P ＜0.01.

表3 Th17 细胞、IL-17 与甲状腺相关抗体相关性Tab.3 Correlation between Th17 cells，IL-17 and thyroid autoantibodies

3 讨论

Graves 病(GD)是由促甲状腺激素受体刺激性抗体(TSAb)过度刺激甲状腺组织，导致甲状腺功能亢进和甲状腺肿大的一种特异器官自身免疫性疾病［7，8］。其病因及发病机制复杂，既往认为Th1 细胞在GD 发病早期起主要作用，Th2 细胞在GD 晚期起作用［9］。随着一种新型CD4+T 细胞——Th17细胞的发现和对其研究的深入，Th17 细胞及其相关细胞因子与GD 的关系受到关注，推测其可能参与GD 的发病，弥补了Th1/Th2 介导效应机制的不足。

3.1 Th17 细胞及其相关细胞因子IL-17 可能参与了GD 的发病 Th17 细胞是一种新型的CD4+效应细胞，具有独立的分化和调节机制。Th17 细胞通过释放细胞因子IL-17、IL-17F 和IL-22，吸引炎症趋化因子和致炎因子聚集到正常细胞周围［10］，IL-17可诱导前炎性细胞因子、趋化因子和基质金属蛋白酶的表达，引起炎性细胞浸润和组织损伤。且IL-17 可与其他致炎信号分子发生协同作用，增加致炎效应。

近年发现Th17 细胞及IL-17 在自身免疫性疾病中发挥重要调节作用，如系统性红斑狼疮(SLE)［11］、银屑病［12］、类风湿关节炎［13］等。Nanba等［14］发现，GD 患者的Th17 细胞的比例明显高于正常对照组，且难治性GD 组的Th17 细胞比例明显高于GD 缓解组。而Kim［15］、Peng［16］等国内外相关研究结果显示，Th17 细胞及IL-17 水平在GD 组中明显升高。与以上研究结果一致，本实验结果显示131I 治疗组、MMI 治疗组GD 患者治疗前(T0)外周血Th17 细胞/CD4+T 细胞百分率及IL-17 水平明显高于正常对照组(P ＜0.01)。提示Th17 细胞可能在GD 发病中起重要作用。通过比较研究不同遗传背景下NOD-H2 (h4)的鼠模型中，只有IL-17(+/ +)发生了Graves 病，Horie 等［17］进一步证明了Th17 细胞在GD 发病机制中起一定的作用。

3.2131I、MMI 治疗GD 对Th17 细胞、IL-17 可能产生不同影响 临床GD 治疗方法为放射性131I 治疗和口服药物治疗，常用口服药物为甲巯咪唑和丙硫氧嘧啶，因丙硫氧嘧啶有较明显副作用故对于一般GD 治疗临床多选用MMI。既往研究表明，131I、MMI对GD 患者具有一定的治疗甲状腺功能亢进作用之外的免疫调节作用，可调节细胞因子水平［18-20］。马学芹［21］等对经131I 治疗的初发GD 不同时间IL-17A、IL-17F 的测定，发现此二因子在131I 治疗后水平下降，与治疗前相比具有统计学意义。本实验结果提示131I 治疗组治疗前后(T0、T1、T3)甲状腺激素水平亦呈下降趋势，且Th17 细胞/CD4+T 细胞百分率及IL-17 水平均明显下降(P ＜0.01)，与Nanba、马学芹等研究结果相符，表明131I 治疗可通过影响Th17 细胞从而起到治疗GD 的作用。目前对131I 治疗对免疫系统影响的机制研究较少，尚未提出一定的概论，考虑Th17 细胞、IL-17 的水平下降一方面与131I 释放β 射线破坏甲状腺组织，使甲状腺相关抗原耗竭，甲状腺内活性T 淋巴细胞及相关细胞因子清除有关，另一方面甲状腺功能紊乱的纠正可减少对免疫的损伤。Klatka 等［22］通过对比初发GD 组和经MMI 治疗后病情缓解组患者外周血中Th17 细胞比例及绝对计数(P ＜0.05)，提示MMI 对GD 患者Th17 细胞有一定的调节作用。采用单因素重复测量的方差分析:本实验MMI 治疗组外周血Th17细胞/CD4+T 细胞百分率及IL-17 水平，在治疗前后无明显统计学差异(P ＞0.05)，与Figueroa-Vega等［10］研究得出甲巯咪唑无法抑制Th17 细胞分泌细胞因子观点一致。但和Klatka 等研究结果存在一定差异，可能与病人基因背景、病情严重程度、疾病阶段不同等相关。以上结果显示两种治疗方式对GD 的Th17 细胞、IL-17 可产生不同影响。国内外对131I、MMI 治疗与免疫系统的关系研究仍较少，此方向尚待深入探讨。

综上所述，本研究通过比较两种治疗方案GD患者外周血中Th17 细胞、IL-17 的变化，反映出Th17 细胞及其相关因子可能参与了GD 的发病过程，并为放射性131I 可能对Th17 细胞及IL-17 产生一定作用提供了依据。但本研究存在样本量较小等局限，对于Th17 细胞如何在GD 发病机制中起作用，以及两种治疗方法是否可直接调节免疫系统治疗GD，仍需进一步研究。

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