胶质瘤相关分子标志物和异质性的研究进展

胶质瘤相关分子标志物和异质性的研究进展

韩剑孙泽林

(华北理工大学附属医院河北唐山063000)

[关键词]胶质瘤异质性分子标志物

[中图分类号]R 57

[文章编号]2095-2694(2015)06-247-06

【作者简介】韩剑(1989-)，男，硕士。研究方向：胶质瘤。

【通讯作者】孙泽林。

胶质瘤是颅内最常见的肿瘤，由于具有难治性、局部浸润性生长和复发等特点，预后很差,临床以手术、放射治疗和化学治疗为主。尽管胶质瘤临床诊疗技术有了日新月异的进步，但其复发仍是不可避免的。不同发病阶段、不同患者、相同患者不同肿瘤部位之间的基因型存在差异。在时间、个体之间的差异被称为肿瘤之间的异质性[1]。肿瘤内部不同区域，随着疾病的进展出现的不同亚型的细胞，称为肿瘤内部的异质性[2,3]。近年来，以肿瘤免疫治疗为代表的分子靶向治疗有了突飞猛进的发展。而特异性的分子标志物被认为是免疫治疗的核心环节[4]。

随着二代测序技术的应用，对肿瘤不同区域及时间点来源的样品进行外显子测序、染色体变异分析及倍性分析使得人们更好地了解了肿瘤的异质性，但由于技术相对复杂、对设备的要求条件高、花费昂贵且用时较长等原因并不能在临床上得以推广应用。目前一些研究较多的胶质瘤分子标志物已经可以用相对简单的方法进行检测，为胶质瘤分子标志物在临床的应用提供了可能。

1胶质瘤的异质性

胶质瘤，被世界卫生组织(World Health Organization WHO)分成4级。其中恶性程度最高的为多形性胶质母细胞瘤(GBM glioblastoma multiforme WHOⅣ)，是成人中最常见且侵袭性最强的颅内恶性肿瘤，占颅内原发肿瘤的16%，占胶质瘤的50%。其预后差，中位生存期约为15个月，确诊后的5年生存率小于5%[5,6]。GBM严重影响患者的生命健康，成为了分子标志物诊断和靶向治疗的热点。GBM的分子标记物与肿瘤的基本特性及肿瘤的临床发展及结果关系紧密，可以指导肿瘤的诊断和治疗，已经逐渐成为神经病理诊断的一部分。

美国癌症基因组图谱(TCGA)计划研究小组根据GBM所发生的EGFR、TP53、IDH1、PDGFRA和PTEN的改变将GBM分为4种亚型：神经元前型(proneural)、经典型(cliassical)、间质型(mesenchymal)和神经原型(neural)[7]。GBM所发生的异常改变主要涉及到3条信号通路，分别为：RTK/RAS/PI3K、p53及Rb通路[8,9]。一项对于11例胶质瘤患者的临床标本进行的研究指出，在同一肿瘤团块内存在着具有不同的标志物改变的肿瘤细胞，即存在不同的分子亚型[10]。另有一项对于GBM的不同区域(肿瘤实质、坏死部位，肿瘤周边)取材的研究也得出类似的结果[5]。说明了GBM的瘤内部异质性的存在，但特定标志物的靶向治疗(如关于EGFR的靶向治疗药物埃洛替尼的研究)并未取得期望的疗效[11]。产生这一现象的原因可能为，存在其他代替治疗靶点(如EGFR)的标志物变异，激活了下游的信号通路。并且这些关于同一通路的变异存在于不同的肿瘤细胞，在同一肿瘤实体内形成不同的亚群[12]。TCGA认为来自同一实体GBM中至少含有两种肿瘤亚型[7]。很多对肿瘤的分子标志物异质性的研究发现，一些标志物的改变是被所有肿瘤细胞所共有的，一些变异是一部分细胞所具有的，而另一些变异是某些细胞所特有的；共有的变异是发生在肿瘤发展过程中的早期事件，而其余的变异则是肿瘤发展的晚期事件[10]。针对肿瘤分子标志物的研究揭示了胶质瘤发生发展的重要信息。对肿瘤患者进行分子亚型的筛选可使肿瘤的诊断更准确，治疗更合理。

2胶质瘤的分子标记物

2.1异柠檬酸脱氢酶(IDH)突变异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)包括3个亚型即：IDH1、IDH2、IDH3，在胶质瘤中所发现的突变主要为IDH1，IDH2的突变发生率较少[13]。野生型的异柠檬酸脱氢酶IDH1/2催化异柠檬酸盐生成酮戊二酸，并且还原NADP+为NADPH。酮戊二酸和释放的NADPH都可以保护细胞免受氧化损伤，具有解毒作用。IDH1存在于细胞质、内质网中，IDH2存在于线粒体中[14]。

IHD1突变最常见的为132位的精氨酸取代组氨酸(R132H)，IDH2的突变多为172位的精氨酸取代组氨酸(R172H)。这些杂合性突变导致IDH失去催化异柠檬酸盐氧化羧化形成酮戊二酸的能力，细胞内酮戊二酸及NADPH的含量减少。突变后的IDH获得了将酮戊二酸转化为2-羟戊二酸(2-HG)的能力，进一步消耗了NADPH。即：IDH突变导致细胞内NADPH的含量减少，2-HG含量增加。2-HG与脑内高水平的活性氧密切相关，含量增加可促进肿瘤的形成。同时，2-HG可以竞争性抑制调节DNA甲基化和组蛋白去甲基化的酶，这将导致CpG岛的甲基化[13]。NADPH的含量减少，致使细胞更易受到氧化损伤。

临床上，发生IDH突变的胶质瘤患者年龄较轻，II～III级的星形细胞瘤、少突胶质瘤及继发性胶质母细胞瘤(由低级别胶质瘤进展而来的GBM)中多见[15]。野生型IDH1/2的GBM大都为原发GBM，具有7号染色体的扩增、10号染色体的缺失及EGFR扩增的特点。突变型IDH1/2的GBM大都为继发GBM，不具备上述突变。IDH突变合并1p/19q的共缺失的胶质瘤多为少突胶质细胞瘤[16]。在星形胶质瘤中IDH突变往往和TP53突变、MGMT甲基化及PDGFRA的过度表达共存。IDH突变的特征已被应用到对胶质瘤预后的判断[17～19]：具有IDH1/2突变的患者预后好，生存期长[20～22]。有研究发现携带IDH1突变的患者其生存期(31月)明显高于未携带该突变的患者(15月)，并发现IDH突变与患者的肿瘤级别呈负相关(II级、III级、Ⅳ级表达率分别为：77%、55%、6%)，同时该突变与患者的治疗效果呈正相关[23]。

2.2染色体1p/19q染色体1p/19q共缺失发生于19号染色体长臂(19q)和1号染色体短臂(1p)上，其常见的缺失区域为19q13.3和1p的1036.3附近。由1994年Reifenberger等首先发现[24]。1p/19q共缺失的胶质瘤较少发生于非颞叶，颞叶少突胶质细胞瘤的1p/19q多不发生突变[25,26]。

1p/19q共缺失与少突胶质细胞瘤高度相关，其在II级少突胶质细胞瘤中的发生率约为61%～89%，在III间变型少突胶质细胞瘤中为13%～20%，而在星形胶质细胞瘤和GBM中其发生率相对较低，分别为7.5%～25%和2.9%～3.7%[27]。因此，1p/19q共缺失被认为是少突胶质细胞瘤的病理学特点。另外，1p/19q共缺失是低级别胶质瘤预后良好和化疗敏感的重要指标。在间变型少突胶质细胞瘤和II胶质瘤当中，存在1p/19q共缺失的患者其中位生存期较无共缺失的患者要高(分别为12～15年∶6～7年，5～8年∶2～3年)，存在1p/19q共缺失患者的5年生存率明显高于无突变者[28,29]。对25名胶质瘤患者应用TMZ进行化疗发现存在1p/19q共缺失突变的患者反应率高于无该突变的患者[88%(8/9);25%(4/16)]，且其无进展生存期的比值为24.5月∶13.7月，总生存期的比值为66.8月∶15.2月，均高于无共缺失的患者[30]。存在该突变的患者肿瘤直径的增长速度小于无该突变的患者(3.4∶5.9mm/年，P=0.0016)，TMZ化疗后复发的比例小于无突变的患者(16.6%∶58%，P=0.004)，1p/19q共缺失可能延缓了TMZ耐药性的产生[31]。

2.3表皮生长因子受体(EGFR)突变表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)为酪氨酸受体家族的一员，其分子量为170KD，其基因定位在7号染色体的短臂上。其与配体结合后，经跨膜部分激活细胞内一系列蛋白分子，并将信号传导到细胞核，引起基因的转录、编码、细胞生长繁殖及分化所必需的蛋白质，最终调节细胞的生长及分裂，促进肿瘤的发展、增殖及血管增生[32,33]。GBM中所发生的EGFR的变异主要存在于肿瘤细胞的胞外侧，而其他肿瘤细胞的EGFR的改变主要在胞浆侧[34]。

约40%的原发型GBM存在EGFR基因的扩增[35]。此外在GBM还存在EGFR基因外显子2～7的缺失，这将导致转录产物的N端丢失267个氨基酸，致使其丢失结合配体的活性，但可表现为受体的独立活性。这是由于其酪氨酸残基发生磷酸化，可以在缺乏配体的情况下单独促进细胞生长。这种由缺失了外显子的基因所编码的产物称为EGFRvIII。EGFRvIII突变的肿瘤细胞不仅可以促进自身的增殖，而且可以促进其周边具有正常EGFR表达的细胞的增殖[36]。大约50%的含有EGFR扩增的GBM同时含有编码EGFRvIII的突变，这些变异均促进肿瘤的发展[37]。EGFR的突变除促进肿瘤细胞的增殖外，还具有对细胞的损伤进行修复的功能[38]。有研究发现，在胶质瘤干细胞(Glioma stem cells，GSCs)中也有EGFRvIII的表达，其可以通过MAPK(mitogen-activated protein kinase)信号通路提高JAGGED1的表达水平，而JAGGED1又是NOTCH通路的配体，因此JAGGED1的水平上调可以激活该通路，NOTCH除了具有促进增殖、影响凋亡的作用外，对维持GSCs的自我修复和去分化起主要作用，可见EGFR在维持肿瘤细胞干细胞特性上也起着重要的作用[39]。在GBM中EGFR基因的扩增和突变是不同的生物学过程，扩增为正常的EGFR表达水平上升，突变是产生不依赖于配体的变异型EGFR，具有独立促进胶质瘤的发生、发展的能力。

虽然原发型GBM与继发型GBM在组织学上难以进行区分，但由于EGFR的异常改变主要存在于原发型GBM中，可由此进行分子病理学的鉴别。在一项针对EGFR水平上调及EGFRvIII突变对患者生存期的影响研究中，无EGFR改变、存在EGFR水平上调改变及存在EGFRvIII突变的患者其生存期分别为0.96、0.98和1.07年，差异无统计学意义(P>0.5)，不能预示患者预后差。而在患者生存时间≥1年的患者中无EGFR改变、存在EGFR水平上调改变及存在EGFRvIII突变的分别为2.03、2.02和1.21年，差异有统计学意义(P<0.5)，由此可见EGFR以及EGFRvIII突变与患者的生存期呈负相关[40]。

2.4O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)启动子甲基化MGMT(6O-methylguananine-DNA methyltransferase)是一种普遍存在的DNA修复酶，可以移除DNA鸟嘌呤O6位点的烷基化加合物移除，使其转移到自身的145位的半胱氨酸残基上，从而能够保护细胞对抗烷化剂的损伤。这一过程不需要其他辅助因子参与，同一蛋白既是甲基转移酶，又是甲基受体。同时MGMT也因甲基化而失活，这一过程被称为自杀性修复。失活的蛋白从DNA上释放下来，通过泛素化路径降解。细胞对DNA的修复取决于胞内MGMT的含量和合成速度。MGMT的表达与MGMT启动子区域CpG岛是否甲基化密切相关。

研究表明约40%的原发型GBM含有MGMT启动子甲基化的改变[41，42]。MGMT启动子甲基化的改变在继发型GBM形成的早期阶段发生，并与这个阶段发生的TP53突变关系紧密[41]。MGMT启动子甲基化的患者对烷化剂(TMZ，Temozolomide)的敏感性较未甲基化的患者要高。MGMT启动子甲基化合并IDH1/2突变的胶质瘤患者生存将明显延长[43]。在一项对胶质瘤患者进行放疗及放疗辅助TMZ化疗的研究中，应用放疗结合TMZ化疗时MGMT启动子突变的患者中位生存期明显高于无突变者(21.7个月：12.7个月)，而进行单独放疗的患者中突变和无突变者的中位生存期差异不大(15.3个月：11.8个月)[44]。说明MGMT 启动子甲基化是良好预后和TMZ敏感性高的标志。

2.5人端粒逆转录酶(hTERT)启动子突变在细胞的不断分裂的过程中，染色体末端的端粒不断地缩短，从而使细胞衰老，人的端粒酶可以维持染色体末端端粒的长度，从而使细胞处于不断分裂的状态，而在大部分肿瘤中均存在维持端粒活性的变异。人端粒酶是一种核糖核蛋白复合物，由人端粒逆转录酶(hTERT,human telomerase reverse transcriptase)、人端粒酶RNA组分(hTR,human telomerase RNA component)以及人端粒酶相关蛋白(hTEP1,human telomerase-associated protein 1)组成。人端粒逆转录酶(hTERT)基因位于5号染色体短臂的最末端(5p15.33)，为一单拷贝基因，其长度为40kb。端粒酶逆转录酶是端粒酶的催化亚基。TERT启动子的突变主要发生在转录起始位点上游的124位(C228T)和146位(C250T)，这些突变将增强TERT启动子(TERT promoter)的活性。有研究表明TERT启动子的突变将增强端粒酶的表达水平及端粒酶的活性[45]。对胶质瘤进行基因分析后发现，大约70%～80%原发型GBM和70%的少突胶质细胞瘤具有TERT启动子的突变，但TERT启动子的突变在发生IDH1/2突变的星形胶质细胞瘤和继发型GBM中却少见[46]。在胶质瘤的研究中由于hTERT启动子的突变发生在疾病进展的早期而备受关注[46,47]。

目前已在脑肿瘤研究中发现TERT的表达预示着患者的预后差[48]。含有TERT启动子突变的GBM患者其总生存期缩短，TERT的表达水平与患者的生存期成负相关，与胶质瘤的恶性程度成正相关[49]。TERT启动子的突变与IDH1及TP53突变呈负相关，而与EGFR的扩增呈正相关[49]。应用该突变与胶质瘤的其他变异可以对患者的预后及生存期进行预测，如在III～IV胶质瘤患者中，同时具有IDH与TERT突变的患者中位生存期约为125个月，主要为少突胶质细胞瘤；单独具有IDH突变的患者中位生存期约为57个月，主要为星形细胞瘤；单独TERT突变的患者中位生存期约为11.5个月，主要为原发型GBM[17]。

2.6ATRX突变ATRX(alpha thalassemia/mental retardation syndrome X-linked)基因所编码的蛋白为染色质重塑蛋白，ATRX蛋白可与DAXX(death-domain associated protein，死亡结构域相关蛋白)所形成复合体与组蛋白H3.3相互作用聚集染色质和端粒[50]。ATRX的突变将导致端粒的不稳定，细胞的无限分裂，且这种无限分裂活性不依赖于端粒酶的改变，被称为ALT(alternative lengthening of telomeres)[50]。ARTX与TERT启动子突变的差别在于，前者存在于不具有端粒酶活性的细胞中，而TERT启动子的突变则是增强了端粒酶的活性。

在胶质瘤当中，ATRX突变主要发生在II、III级星形细胞瘤，少突星形胶质细胞瘤和继发型GBM中。原发型GBM、少突胶质细胞瘤和儿童GBM中较为少见的。与ATRX突变相反，TERT启动子的改变主要见于原发型GBM和少突胶质细胞瘤中。几乎所有含有ATRX突变的胶质瘤均同时存在IDH突变，同时存在这两种突变的肿瘤中，大部分又同时具有TP53突变[51]。同时存在IDH和ATRX突变的胶质瘤可作为病理诊断星形细胞瘤的诊断要点[52]。

2.7P53突变P53是一种抑癌基因，基因全长约20kb，位于17号染色体的短臂上，编码一个分子量为53kD的核内磷酸化蛋白，与细胞周期的调控、DNA复制、细胞分化及凋亡等生物学功能有关。P53蛋白可分为3部分：N端为反向激活域；中央为DNA特定结合域；C端为四聚体化结构域，P53蛋白被激活后形成含有393氨基酸残基的同源四聚体[53]。P53蛋白主要分布在核浆中，能与DNA特异的结合，其活性受磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等翻译后修饰调控，正常的P53在G1期检查DNA损伤点，监视基因组的完整性，若存在损伤，P53蛋白则组织DNA复制，为DNA修复提供足够的时间，若修复失败，P53蛋白引发细胞凋亡，但突变后的P53不仅失去了抑癌的功能，其编码的蛋白产物mutP53(mutation P53)为一种致癌因子[53,54]，mutP53可以促进肿瘤的发展，通过抑制wtP53(wild type P53)来增强肿瘤的侵袭性，其可与wtP53发生聚合，来影响其活性。

P53突变发生在约50%的弥散性星形细胞瘤、间变型星形细胞瘤和继发型GBM中，很少见于少突胶质细胞瘤[55,56]。大多数IDH1突变的星形细胞瘤同时具有P53突变。而在不含IDH1/2突变的星形细胞瘤中却较少出现P53突变。IDH1/2突变的间变型星形细胞瘤和GBM中也多含有P53突变[55]。由于该突变主要存在于II、III级星形细胞瘤，并且较少存在于少突胶质细胞瘤中，因此可把P53作为胶质瘤诊断分类的一个标记物。P53突变的胶质瘤患者发病年龄较大者预后差，对放化疗均有抵抗[57]。

2.8其他分子标记物由于GBM中所发生的生物活性的改变主要涉及P53、Rb及RTK/Ras/PI3K这3条通路。因此除上述研究较成熟的分子改变外，还涉及到许多与这3条通路相关的分子标记物的改变。如涉及P53通路的MDM2/4(Murine Double Minute 2/4)及TP53，与Rb通路相关的CDK4、CDK6、CDKN2A/B，以及与PI3K(phosphatidylinositol 3-kinase)通路相关的PIK3R1、PTEN、NF1等的改变。并且这些标志物之间也存在着一定的联系。更好地了解这些标志物变异情况，将有助于研究GBM的发生、发展及发现更有效的治疗方法。

3展望

目前还没有任何一种分子标志物可以涵盖所有的胶质瘤。综合分析多种分子标志，可更好地了解胶质瘤的生物特性，将胶质瘤分为不同的亚型，指导临床的治疗及预后的判断。但由于异质性的存在，随着肿瘤的发展，单次活检已不能适时地反应肿瘤的情况。如何准确全面地进行病理检测已成为目前胶质瘤诊断及治疗的首要问题。单一部位的病理取材并不能完全地表现肿瘤的异质性。针对脑胶质瘤，尤其是不适于手术的胶质瘤患者，进行多点取材可增加胶质瘤诊断的全面性，是研究的重要方向之一。

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(王一伊编辑)