2型糖尿病与海马蛋白表达关联性的研究进展

2型糖尿病与海马蛋白表达关联性的研究进展

涂画高翔陈雪品①成曦爽①石亚静①韩淑英①郭兰②

(华北理工大学药学院河北唐山063000;①基础医学院;②冀唐学院)

[关键词]2型糖尿病海马蛋白学习记忆关联性

[中图分类号]R 587

[文章编号]2095-2694(2015)06-244-03

【基金项目】华北理工大学大学生创新实验计划项目(编号：x2015214)；唐山市“十二五”科技重点项目(编号：10130203)。

【作者简介】涂画(1994-)，女，华北理工大学在读生。研究方向：中药药学。

【通讯作者】韩淑英。

随着经济的发展和人民生活方式的改变以及人口老龄化，2型糖尿病(T2DM)的发病率在全球范围内呈逐年增长的趋势，尤其是在发展中国家和部分发达国家中，其增长速度更快。T2DM是老年人群中常见的代谢性疾病，随着病程的延长，T2DM可导致中枢认知功能的损害，尤其是学习和记忆能力的下降，甚至发展成阿尔兹海默症(AD)[1]，现在多称由糖尿病所引起的学习障碍为“糖尿病脑病”[2]。国内外研究表明，糖尿病引发认知学习记忆功能障碍的核心在于脑神经元的受损、缺失和功能下调[3]，而海马又是学习、记忆、认知功能的重要脑组织，多种海马蛋白的表达以及糖尿病的发生会影响海马突触的可塑性[4,5]，提示糖尿病病程中海马蛋白改变可能是导致发生学习记忆障碍的重要原因。

1海马内病理过程相关蛋白

1.1载脂蛋白E (ApoE)在脑内，ApoE主要是由星形胶质细胞和小胶质细胞表达。ApoE与淀粉β样蛋白(AB)结合，可以导致神经元细胞变性甚至死亡，引起细胞外老年斑的增加(SP)和乙酰胆碱(Ach)的不足，从而引起学习记忆功能障碍[6,7]。石梅[3]等将大鼠禁食24h，按55mg/kg腹腔注射链脲佐菌素建立T2DM模型；经旷场与Mirros水迷宫测试发现，T2DM大鼠发生了学习记忆功能障碍，测试后立即处死大鼠取海马组织，通过目的基因反转录-聚合酶链反应分析，发现糖尿病模组海马的ApoE mRNA表达水平较正常对照组明显增加，而皮层的ApoE mRNA表达水平与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。提示T2DM使得大鼠脑内海马的ApoE mRNA的表达水平升高,与学习记忆障碍的发生有关。

1.2Aββ淀粉样前体蛋白(APP)在分泌酶的作用下剪切成Aβ。Aβ是一种神经毒性物质，可以引起细胞内钙离子超载，损伤内皮细胞致使细胞的内环境失衡而促进氧自由基(ROS)的生成，引起神经元的损伤和死亡。现代研究表明，大脑皮层及海马区的 Aβ 在胞外积累并形成SP，正是AD的病理特征之一[8]。提示糖尿病病程中海马中Aβ沉积是造成学习记忆障碍的重要原因。孙忠文[9]等以GK大鼠为T2DM实验组模型，wistar大鼠为正常对照组，适应喂养1周后取脑。通过免疫组织化学染色法检测脑组织肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样因子2(TIPE2)和Aβ1-40的表达及空间分布，结果表明，Aβ1-40主要分布于皮质和海马等组织结构的神经元、神经胶质细胞和血管壁，并且证明TIPE2蛋白的表达与Aβ1-40水平呈正相关。提示免疫调节因子TIPE2可能通过其免疫负调控作用，使Aβ沉积诱发炎症反应，促使糖尿病脑组织的损伤。王苗[10]等采用高脂高糖饮食加小剂量腹腔注射链脲佐菌素建立T2DM大鼠模型，将wistar大鼠分为3、6月龄正常组与3、6月龄T2DM组，应用酶联免疫吸附试验(Elisa)法测定低密度脂蛋白受体相关蛋白1(Lrp-1)、Aβ1-40在脑组织的表达量。其中Lrp-1介导的转运清除对脑内Aβ1-40动态平衡的调节起重要作用。研究结果表明，Aβ1-40表达于大鼠大脑皮质、海马等处的神经元、神经胶质细胞的胞浆、胞膜及软脑膜动脉和穿支动脉的外膜及平滑肌细胞处；在同月龄大鼠中，糖尿病组Aβ1-40在脑组织中表达均较正常大鼠组明显增多，Lrp-1的表达明显减少，提示Aβ1-40沉积可能与Lrp-1的表达下调有关，进而使得Aβ的清除受阻，造成脑内沉积，可能导致学习记忆发生障碍。

1.3tau蛋白tau蛋白是脑内神经元细胞重要的支架蛋白之一，其可促进微管的形成以及维持其稳定性，而微管参与维持细胞形态、信息传递以及轴突的形成。tau蛋白的过度磷酸化使其成为毒性分子而聚积成双螺旋纤丝(PHF)和束状细丝(SF)，形成神经元纤维缠结(NFT)。若其从微管中释放出来，会导致细胞骨架异常、轴浆运输障碍，这种改变与认知障碍和记忆缺失有着密切联系[5]。杨雁[11]等从20只雄性SD大鼠中挑选16只以高脂高糖高蛋白饲料喂养，再从其中取8只按照20～25mg/kg剂量一次性腹腔注射链脲佐菌素，尿糖持续阳性，T2DM造模成功为T2DM组，余下8只为肥胖组(OB组)。采用蛋白质印迹研究T2DM及单纯肥胖大鼠脑中海马回 tau 蛋白磷酸化程度，发现在这两种大鼠模型中海马 tau 蛋白在多个位点上都呈现过度磷酸化状态。另外，海马神经细胞膜上胰岛素受体 β亚基水平在两种实验模型中显著下降。提示T2DM及肥胖可能通过增高胰岛素抵抗，导致tau 蛋白的过度磷酸化，增加学习记忆障碍的风险。

1.4钠钾泵ATP酶(NKA)NKA是细胞膜上物质转运、能量转化和信息传递的重要蛋白酶。糖尿病时葡萄糖增高使细胞的多元醇代谢途径激活,引起神经组织“伪缺氧”、自由基生成增多和Na+-K+ATP酶活性降低等变化，其中Na+-K+ATP酶活性的降低可导致突触内Na+堆积,以致神经传导速度减慢[12]。同时细胞内的Na+增多和Ca2+的蓄积，可以导致细胞损伤。因此糖尿病程中海马中的NKA的改变可能是导致大鼠学习记忆障碍的重要因素。林军[13]等将大鼠禁食24h,按55mg/kg腹腔注射佐链霉素建立T2DM模型。以旷场分析法和Morris水迷宫法考察各组大鼠学习记忆能力,检测大脑皮层和海马的Na+-K+ATP酶活性。结果表明，糖尿病大鼠旷场分析表现出中央格停留时间延长、探洞次数较少、Morris水迷宫实验示逃避潜伏时间延长、搜寻平台策略成绩降低。T2DM模型对照组动物大脑皮层和海马的Na+-K+ATP酶活性较正常对照组下降，大脑皮层和海马的Na+-K+ATP酶活性明显下降。预示着这两脑区的神经功能发生病理学改变,因而学习记忆功能出现障碍。

1.5胰岛素受体底物-1(IRS-1)IRS-1是胰岛素信号的传导分子，组织细胞内IRS-1蛋白表达是胰岛素信号传导的基础。庄晓明[14]等以KKAy小鼠置于SPF环境中饲养建立T2DM模型，处死后立即取海马组织，并将海马组织切片进行免疫组织化学染色以及免疫组化定量分析。结果表明，糖尿病组电镜下海马区的神经元核膜凹陷，海马神经元胰岛素受体(InsR)阳性反应神经元数目比正常对照组明显减少、染色淡、突起少，DM组海马(InsR)、IRS-1的表达低于正常组。提示胰岛素信号传导阻滞是可能导致神经元的退行性变的原因之一。

2海马神经元凋亡相关蛋白

细胞凋亡是细胞的程序性死亡，是多基因调控的细胞自杀性凋亡。但异常的激活凋亡因子加速正常细胞的凋亡，会造成组织、细胞的损伤。在Bcl-2家族中，细胞是否进入凋亡程序取决于Bcl-2与Bax的相对数量，Bcl-2/Bax的比值改变与神经元凋亡密切相关；在caspases级联反应中，caspases-3是最关键的效应蛋白，其引起核酸断裂，引起细胞凋亡；而凋亡诱导因子(AIF)也是caspases级联反应中重要的调控蛋白。吴亮[15]等用高脂饮食加小剂量30mg/kg链脲佐菌素诱导T2DM模型，Morris水迷宫法评价大鼠学习记忆能力、Western blot法检测大脑皮层及海马组织Bax、Bcl-2、caspase-3、AIF蛋白表达水平。Morris水迷宫测试发现，与正常组比较，T2DM组大鼠第5天潜伏期明显延长，第5天搜索策略明显变差；海马中caspase-3、AIF蛋白表达升高(P<0.05)，Bax蛋白表达明显升高(P<0.01)，Bcl-2蛋白表达无明显变化。这均提示糖尿病时神经元内凋亡蛋白与促凋亡蛋白的表达占优势地位，这可能是神经元数目变少并导致认知障碍的直接原因。庄晓明[16]等在研究APP17肽对T2DM KKAy小鼠大脑海马神经元部分信号转导蛋白表达的影响中，利用免疫沉淀并蛋白印迹法检测海马中pMAPK、CREB、pCREB、Bax、Bcl-2等凋亡蛋白的表达。结果表明：KKAy小鼠海马神经元的P-MAPK表达下降，其他均表达正常，并且没有出现Tunel阳性细胞，说明海马神经元未出现凋亡。

3其他相关蛋白

3.1NO合酶NO合酶是催化L-精氨酸生成NO的重要蛋白质，因为NO极易扩散且半衰期短，所以NO的作用与NOS密不可分。NO是一种新型神经递质和信息分子，参与学习记忆过程，在神经系统中具有重要作用。张松筠[17]等用6周龄雄性糖尿病C57BL/KsJ db/db小鼠与正常对照组相比, 通过NADPH-d组织化学反应观察糖尿病组小鼠海马齿状回NOS阳性神经元密度显著减少(P<0.01)。提示糖尿病病程中NOS阳性神经元数量减少影响了NO的合成，从而使糖尿病中枢神经系统功能发生障碍。李强[18]等以小剂量链脲佐菌素连续腹腔注射建立T2DM大鼠模型，通过SP免疫组化染色观察海马神经元nNOS的表达。结果显示nNOS免疫阳性产物呈棕黄色细腻颗粒状，位于海马神经元的胞浆。与正常对照组大鼠相比，糖尿病，模型组大鼠海马神经元nNOS的表达明显升高(P<0.01)。提示过量的NO会产生神经毒性作用，最终引起海马组织的损伤。

3.2NAA/Cr、Cho/Cr乙酰天冬氨酸复合物(NAA)作为可神经元的标志物在神经元线粒体中代谢，主要是反映神经元的密度及完整。胆碱复合物(Cho)主要是参与神经元细胞髓鞘的形成，是反映细胞膜磷脂分解、合成的指标，细胞崩裂时可引起Cho水平的升高。Cho还是记忆认知、情绪行为等重要神经递质乙酰胆碱的前体。提示Cho含量的升高可能导致学习记忆障碍。周红[4]等以21例T2DM患者为对象，进行听觉词语记忆测试-延迟回忆项(AVLT-delayrecall、AVLT-recognition)和画钟测试(CDT)等认知功能评估测试，常规行MR横断、矢状及垂直于海马长轴的斜冠状面多序列成像,取垂直于海马长轴的T2WI定位相，对所得谱线进行相位、基线校正，并计算出NAA/Cr、Cho/Cr的比值。结果表明：T2DM患者AVLT-delayrecall、AVLT-recognition和CDT测试成绩均明显低于正常组,差异有统计学意义(P均<0.05)，T2DM患者双侧海马NAA/Cr均降低(均P<0.01)，并以左侧为著(P<0.05);左侧海马Cho/Cr增高(P<0.05)。提示糖尿病引起海马的多项指标代谢异常，出现认知功能的障碍，可认为左侧海马代谢可能与记忆损害密切相关。

综上所述，T2DM所导致的糖尿病脑病的发病机制相当复杂，海马蛋白的改变会使脑内有关学习记忆的神经元的改变，从而发生学习记忆障碍，提示T2DM所致海马内蛋白表达异常是发生糖尿病脑病的重要机制。

参考文献

[1]许保磊,王蓉,张茁. 阿尔茨海默病与3型糖尿病[J].中华老年心脑血管病杂志,2012,14(12):1338-1340

[2]Willem Hendrik,Geert J B. Cognition and synapticplasticity in diabetes mellitus[J]. Trends Neurosci，2000,23:542-549

[3]石梅,林军,梁志峰. 银杏叶提取物对糖尿病学习记忆功能障碍大鼠脑内载脂蛋白 EmRNA 表达的影响[J].中国临床康复,2006,10(11):26-29

[4]周红,卢万俊,滕皋军,等.2型糖尿病患者认知功能及海马氢质子磁共振波谱研究[J].中国中医影像技术,2009,25(8):1367-1370

[5]樊睿，朱绍琼. 海马蛋白与学习记忆的研究[J]. 现代医药卫生,2011,27(24):3745-3747

[6]魏小龙,张永祥.老年性痴呆相关的脑内调控基因[J].中国药理学通报,1999,15(2):119-123

[7]郑昆文,赵重波,张金章.ApoE与 Alzheimer 病的研究进展[J].神经疾病与精神卫生,2003,3(2):161-162

[8]杨红梅,赵佳,李真. 2型糖尿病及中枢胰岛素抵抗与认知功能障碍[J]. 河南职工医学院学报,2013,25,(5):660-662

[9]孙忠文,杜鹃,鲍梦馨,等. 2型糖尿病大鼠脑组织 TIPE2的表达特征及其与Aβ1-40 沉积的相关性[J].山东大学学报(医学版),2013,51(3):10-14

[10]王苗,朱梅佳, 赵张宁. 不同年龄糖尿病大鼠脑组织LRP-1表达与Aβ1-40的相关性[J].山东大学学报(医学版),2010,48(3):19-23

[11]杨雁, 胡蜀红,张建华,等. 肥胖及2型糖尿病大鼠 Alzheimer 病样Tau 蛋白过度磷酸化修饰及机制探讨[J]. 生物化学与生物物理进展, 2006, 33(5): 458-464

[12]董为伟.神经保护的基础与临床[M].北京:科学出版社, 2002. 326

[13]林军,韦理,黄志明,等.银杏叶提取物对糖尿病大鼠行为学及大脑皮层和海马Na+-K+ATP酶活性的影响[J].广西医科大学学报,2004,31(6):834-836

[14]庄晓明,赵志炜,姬志娟,等. APP17肽对2型糖尿病KK小鼠海马神经元超微结构和InsR、IRS-1的影响[J]. 首都医科大学学报,2002,23(2):115-118

[15]吴亮,刘网网,焦立卓,等. 棉酚对2型糖尿病大鼠大脑皮层及海马神经元凋亡相关基因表达的影响[J]. 温州医学院学报,2013,43(9)：567-577

[16]庄晓明,姬志娟,陈莉,等.2型糖尿病KKAy小鼠海马神经元存活信号转导途径的异常及APP17肽对其的改善作用[J].中国药理学通报,2004,24(1):25-28

[17]张松筠,杨天祝,马常开,等. 2型糖尿病模型db/db小鼠海马NOS阳性神经元化[J]. 解剖科学进展,2002,8(1):22-24

[18]李强,颜勇苏,苏哲君,等. 丝胶对2型糖尿病大鼠海马nNOS表达的作用[J].承德医学院学报,2013,30(2)：97-99

(2015-06-25收稿)(王一伊编辑)