人脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定

韩 华，薛 改，张俊勤，闫 萍，李艳丽

（1.河北省人民医院妇产科，河北石家庄050051；2.中国人民解放军白求恩国际和平医院药剂科，河北石家庄050082；3.中国人民解放军第二六○医院病理科，河北石家庄050041）

人脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定

韩 华1，薛 改2，张俊勤1，闫 萍1，李艳丽3

（1.河北省人民医院妇产科，河北石家庄050051；2.中国人民解放军白求恩国际和平医院药剂科，河北石家庄050082；3.中国人民解放军第二六○医院病理科，河北石家庄050041）

目的 探讨人脐带华通胶间充质干细胞体外分离、培养、鉴定及冻存、复苏的方法。方法 收集健康足月新生儿脐带组织，采用组织块贴壁法分离、培养脐带间充质干细胞，流式细胞仪检测细胞表面抗原，将细胞冻存3个月后复苏，鉴定复苏后细胞的特性。结果 组织块贴壁法获得脐带间充质干细胞成功率高；细胞表面高表达CD29、CD44、CD90和CD105，不表达造血干细胞表型CD34、CD45等；冻存后再复苏细胞活性高达80%～90%。结论 组织块贴壁法可以从人脐带华通胶中较好的分离、培养出间充质干细胞，为干细胞移植实验研究和临床治疗提供了理想的细胞来源。

脐带；间充质干细胞；胎血

干细胞是一群具有自我更新和分化潜能的细胞，根据发育状态可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。其中间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类具有高度自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，在体外可以分化诱导为骨、脂肪、神经等多种组织细胞［1－3］，具有向受损组织归巢并且修复、重建受损或病变组织器官的特点。此外，MSCs还具备免疫原性低、移植成活率高、细胞治疗效果好等特点，因此成为当前干细胞研究的热点。目前临床应用MSCs的主要来源为骨髓、脐带血［4］，但成人骨髓中MSCs数量较少，病毒感染率高，免疫原性强，且取材较复杂，限制其应用［5］。从脐带血中获取MSCs成功率较低，分离数量较少，易受干扰，影响了其临床应用。近年研究显示，人脐带中存在大量的MSCs，与其他来源相比，脐带间充质干细胞（umbilical cord mesencymal stem cells，UC-MSCs）更加易于获得，对母子均无损伤，且冻存和复苏后细胞的生物学性状无明显变化［6］，使其成为细胞治疗中的理想细胞而逐渐替代骨髓来源MSCs。本实验主要研究人UC-MSCs的分离、培养、鉴定，以及细胞的冻存、复苏，旨在为下一步进行细胞移植治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 脐带标本 取自河北省人民医院妇产科，均为正常足月剖宫产新生儿脐带，共10根，排除母儿各种传染性疾病及家族遗传病，获得产妇及家属知情同意。

1.1.2 主要试剂及仪器 DMEM／F12培养液、胎牛血清（fetal calf serum，FBS）、胰蛋白酶／EDTA消化液、CD29-PE、CD44-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD34-PE、CD45-FITC、人白细胞DR抗原-FITC、超净工作台、OLYMPUS倒置显微镜、流式细胞仪、培养箱、离心机、无菌培养瓶等。

1.2 实验方法

1.2.1 UC-MSCs的提取及培养 无菌取剖宫产新鲜脐带约10 cm，生理盐水洗去脐带残留血液，剪成2～3 cm的小段，再次漂洗，纵行剖开脐带，剔除1条脐静脉、两条脐动脉，剥离华通胶。用眼科剪将华通胶剪碎成1 mm3的小组织块，转移至细胞培养瓶中，加入含有体积分数为10%FBS、100 U／m L青霉素、100 mg／L链霉素的DMEM／F12培养液，于5% CO2、37℃的培养箱中静置培养。倒置显微镜每天观察细胞生长情况。1周后首次换液，此后3～4 d换液1次。待细胞长至80%～90%融合时用胰蛋白酶／EDTA消化液消化传代，显微镜下控制消化时间。

1.2.2 流式细胞仪检测细胞表面标志物 分别取原代、第3代、第6代、第9代细胞，达到80%～90%融合时用胰蛋白酶／EDTA消化液消化，制成1× 106／m L细胞悬液。分别加入鼠抗人单克隆抗体CD29-PE、CD44-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD34-PE、CD45-FITC各10μL，充分混匀，室温下反应30 min，每管加入1.5 m L PBS，1 200 r／min离心5 min，弃上清，每管加入100μL PBS，流式细胞仪检测。

1.2.3 UC-MSCs的冻存及复苏 收集第三代刚融合的UC-MSCs，胰酶消化细胞，离心5 min，离心后以FBS配制的10%二甲基亚砜重悬细胞，置入－80℃冰箱，第2天转入液氮中保存。冻存3个月后复苏细胞，从液氮中取出冻存管，将细胞直接放入37℃水浴箱中融化，PBS洗涤2遍，置入含10%胎牛血清的DMEM培养瓶内，放入37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞传代至第3代时，用流式细胞仪检测鉴定，方法同前。

2 结 果

2.1 UC-MSCs的形态学观察 成功从脐带组织中分离出华通胶，经培养后用倒置显微镜观察。接种后1～2 d组织块开始贴壁，7 d后可见部分细胞从组织块周围爬出，形态呈梭形、纺锤形，局部可成集落生长，14 d左右细胞形成片状融合达80%，呈旋涡状生长，即可进行1∶3传代。传代后细胞生长能力明显增强，细胞呈现均一的长梭形，类似成纤维细胞，成典型的旋涡状排列生长。细胞在增殖传代过程中形态无明显变化。

2.2 UC-MSCs的表面标志物测定 流式细胞仪检测UC-MSCs免疫表型，结果显示，原代培养的UCMSCs已经开始高表达CD44、CD90、CD105，但仍表达一定程度的CD34、CD45，而第3代UC-MSCs高度表达CD29、CD44、CD90、CD105等间充质细胞标志，几乎不表达CD34、CD45等造血细胞、内皮细胞标志和主要组织相容性抗原人白细胞DR抗原。2.3 UC-MSCs的冻存、复苏 冻存3个月后再复苏，镜下可见细胞饱满，边缘整齐，形态完整，细胞活力为80%～90%，传代生长良好，与冻存前基本一致。复苏后的细胞传至第3代时，经流式细胞仪检测，其表面标志物测定结果与未冻存的UC-MSCs相似。

3 讨 论

目前，干细胞的研究逐渐成为现阶段的热点。MSCs是来源于中胚层间充质的成体干细胞，主要存在于骨髓、脐血、脐带、外周血等组织中，最早从骨髓中分离得到。但骨髓MSCs取材较困难，污染率高，且随着年龄老化细胞数量和分化能力相对减少和减弱［7－8］，因而限制其临床应用。与其相比，人脐带组织作为“医疗废物”，从中提取MSCs取材方便，不存在伦理问题，且细胞含量高、增殖能力强、免疫原性低，越来越受到研究者的关注。

正常脐带是连接胎儿脐部与胎盘之间的索状结构，表面被覆羊膜［9］，内含2条脐动脉和1条脐静脉。在脐血管周围有黏蛋白样组织包裹，称为脐带华通胶，其富含大量的间充质干细胞、胶原纤维、透明质酸等［10］。目前，从人脐带华通胶中分离和培养MSCs的方法主要有酶消化法和组织块贴壁法。酶消化法操作复杂，耗时长，技术要求高，对细胞机械损伤和化学污染较重。因而，本实验采用组织块贴壁法分离培养MSCs，结果显示组织块在培养7 d左右即有细胞爬出，细胞呈典型的纺锤形，增殖较快，14 d左右细胞呈漩涡状生长，传代后细胞形态以梭形纤维样细胞为主，呈漩涡样生长，生长能力增强。这表明MSCs可以在短时间内贴壁、快速生长，培养的细胞可稳定传代，细胞形态与增殖能力没有明显改变，与国内外研究报道基本一致［11］。

既往研究［12－13］表明，MSCs尚无特异性膜表面相关抗原，但成熟MSCs能够高表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106等膜表面标记物，不表达CD14、CD34、CD45等造血干细胞标志抗原。本实验选取了报道较多的细胞表面标记物，应用流式细胞仪进行检测，结果显示UC-MSCs高度表达CD29、CD44、CD90、CD105，几乎不表达造血干细胞标志物，与骨髓来源MSCs具有相似的免疫表型，同以往研究结果一致。此外，组织相容性抗原人白细胞DR抗原的低表达可以证明UC-MSCs免疫原性弱，不会引起排斥反应，异体移植几乎不受影响。

UC-MSCs的冻存和复苏具有重要的临床价值，需要娴熟的技术和严格的管理，以便很好地保证经分离、冻存、复苏后的UC-MSCs在临床使用过程中的安全性和有效性。本研究结果显示，在UCMSCs冻存复苏过程中，细胞活性及生长速度没有受到明显影响，复苏后的细胞形态、特性及表面标记物测定同冻存前基本一致，为建立UC-MSCs库提供了初步的实验依据。

综上所述，组织块贴壁法分离培养UC-MSCs是一种简便易行、稳定成熟的细胞培养方法。UCMSCs以其来源丰富、取材简单、扩增迅速、细胞数量多、免疫原性低等独特的优点，逐渐成为组织再生医学中最有潜力的种子细胞，给进一步进行干细胞移植实验研究和临床治疗带来了广阔的前景［14］。

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［14］ Fan CG，Zhang QJ，Zhou JR.Therapeutic potentials of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord［J］.Stem Cell Rev，2011，7（1）：195－207.

（本文编辑：刘斯静）

Isolation，culture and identification of human umbilical cord mesenchymal stem cells

HAN Hua1，XUE Gai2，ZHANG Jun-qin1，YAN Ping1，LI Yan-li3
（1.Department of Obstetrics and Gynecology，Hebei General Hospital，Shijiazhuang 050051，China；2.Department of Pharmacology，Bethune International Peace Hospital，Shijiazhuan g 050082，China；3.Department of Pathology，PLA 260 Hospital，Shijiazhuan g 050041，China）

ObjectiveTo explore isolating，culturing，identifying，freezing and thawing mesenchymal stem cells（MSCs）approach from Wharton jelly of human umbilical cord.MethodsThe MSCs were isolated from neonate umbilical cord，cultured by tissue explants adherent method.The surface markers were identified by flow cytometry.Passage cells，frozen 6 months，were thawed，then their biological characteristics were identified.ResultsMSCs were easily obtained from Wharton jelly of human umbilical cord via the proposed approach of tissue adherence.The flow cytometry analysis showed that MSCs expressed CD29，CD44，CD90 and CD105 positively，but negatively for CD34，CD45.The living cells of MSCs were 80%－90%after having been frozen and the thawed cells had the same characteristics as the previous.ConclusionMSCs can be successfully isolated from Wharton jelly of human umbilical cord by this method.The stem cells derived from Wharton jelly of human umbilical cord may be a novel alternative source of human MSCs for experimental and clinical applications.

umbilical cord；mesenchyma stem cells；fetal blood

R394.2

A

1007-3205（2015）01-0021-03

2014－07－22；

2014－09－20

韩华（1982－），女，河北邯郸人，河北省人民医院主治医师，医学硕士，从事妇产科疾病诊治研究。

10.3969／j.issn.1007-3205.2015.01.008