蔬菜类植物组织培养过程中的褐变问题及控制措施

邹甜 ，李涵 ，闵子扬 ，成娟 ，童龙 ，王志伟 ，孙小武 ，2

（1.湖南农业大学，长沙，410128；2.湖南省瓜类研究所）

褐变是指外植体在组培过程中胞内的酚类物质被氧化成醌类物质，从表面向外释放褐色物质，使培养基变成褐色，影响脱分化和再分化，导致外植体最终死亡的现象。褐变在组培过程中普遍存在，它与菌类污染和玻璃化现象是组培过程中的三大难题，能否有效控制褐变是决定组培试验是否成功的关键。组培技术在国内外发展迅速，对褐变的研究也较多，本文综述了蔬菜方面关于褐变的最新研究进展，阐述了褐变发生的原因及有效控制褐变的方法。

1 褐变原因

1.1 非酶促褐变

非酶促褐变不涉及酚类物质的产生，指细胞坏死（细胞自然死亡或外界因素造成的程序化死亡等）而产生的褐变现象。

1.2 酶促褐变

目前认为酶促反应是褐变的主要原因。外植体褐变与其体内的酚类物质含量及多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，简称 PPO）活性密切相关，酚类物质含量高的品种更易发生褐变[1]。而许多植物特别是木本植物中的酚类物质含量非常高。正常条件下，植物组织因细胞膜的分隔作用或多酚氧化酶未被激活，不易发生褐变[2]。当植物组织受伤后，细胞结构遭到破坏，其体内会发生一系列的生理变化，最终导致褐变。而在植物组培过程中，外植体被切开时打破了酚和酶的分布，酚类物质在有氧条件下被迅速氧化成褐色的醌类物质，并逐渐扩散到培养基，同时抑制其他酶的活性，最终导致组织坏死[3]。

2 影响褐变的因素

2.1 外植体

①外植体基因型 一般来说，单宁类化合物和羟酚类化合物含量高的外植体材料更容易发生褐变。李佳等[4]用组织学切片方法观察发现，单宁类物质是导致莲藕愈伤组织褐变的重要因素之一。Mayer等[5]和Kahn[6]的研究均表明，在组织培养过程中褐变与酚类物质含量密切相关，酚类物质含量越高越容易发生褐变。吕颖颖等[7]以8个不同基因型的玉米自交系为材料，在相同条件下培养发现其愈伤组织褐变情况有很大差异。

②外植体年龄 通常取幼龄部位进行组织培养不易褐变，但随着组织的老龄化，植物组织内醌类物质增多而褐变严重。幼胚胚龄是决定胚性愈伤组织褐化程度的重要因素之一。宋钦虎等[8]研究了胚龄对玉米愈伤组织诱导中褐化情况的影响，发现同一自交系的不同胚龄的幼胚褐变程度明显不一样。李海燕等[9]将大豆子叶、胚尖和下胚轴在同一条件下培养，发现较幼小胚尖的褐化率最低。

③外植体取材时间和生理状态 一般在春夏季特别是春季取材的褐变情况较轻，外植体生长旺盛，分生能力强且不易褐变，而以已经木栓化或木质化的枝条和处于休眠状态的芽作为外植体进行组织培养时则褐变严重，这种现象是由于分生部位接种后形成醌类物质较少，而分化部位形成的醌类物质较多导致的。另外值得注意的是，有报道称生长在阴处的外植体比生长在阳光下的外植体褐变率低[10]，而李然红等[11]在取外植体前对母株进行遮光处理，降低了甘蓝愈伤组织褐变率证实了这一观点。

④外植体受伤程度 外植体受伤程度较小时褐变更易控制，所以平常取材时应尽量减少伤口面，保持材料的完整性。Bonga等[12]曾报道，外植体越小，其伤口面与体积的比就越大，越容易发生褐变；Reuveni等[13]取完整的胚和叶片进行培养时褐变率小于不完整胚和叶片的。另外，除取材时的机械损伤外，消毒处理也会使外植体受到一定的伤害。庾韦花等[14]对牛尾菜褐变的研究表明，外植体的褐变率随升汞处理时间的延长呈上升趋势。

2.2 培养基

①盐离子浓度 培养基中的盐离子是外植体生长所必需的，但是盐离子浓度过高却容易促发褐变。有报道称，在低盐浓度的培养基中培养牛尾菜时其褐变程度得到了改善，褐变时间有所推迟[14]。许传俊等[15]研究也发现，MS培养基中的Fe含量增加会导致褐变加重。李然红等[11]将1/2 MS和MS两种培养基对褐变的影响进行了比较，发现以MS培养基培养的甘蓝愈伤组织褐变程度较为严重，这与MS培养基中盐离子浓度较高有关。

②激素种类和浓度 蒋燕等[16]的试验表明，6-BA会影响辣椒子叶愈伤组织褐变的发生。有研究发现，与添加6-BA相比，添加TDZ的基础培养基更有利于减轻蝴蝶兰外植体的褐变[17]。康德贤等[18]在进行辣椒不育系子叶愈伤组织诱导时也发现，添加1.0 mg/L 2，4-D相比同浓度的6-BA更有利于减轻褐化。吕颖颖等[7]却发现2，4-D使用浓度过大（>3 mg/L）时，玉米愈伤组织褐变率会明显升高。

③其他 蔗糖一般被认为是植物组织培养的标准碳源，吕颖颖等[7]在试验中发现，蔗糖浓度在一定程度上影响褐变程度，且随外植体基因型不同有所差异。适当降低pH值，可抑制外植体内多酚氧化酶（PPO）活性，控制褐变发生[19]。在pH值较低，大约为5.5时有利于减轻辣椒外植体的褐变程度[20]。

2.3 培养条件

①光照条件 许多研究表明，暗培养能明显降低外植体的褐变率，因为光照能提高过氧化物酶的活性，从而增大褐变程度。但还需注意的是暗培养时间过长不利于外植体的生长，应根据具体情况和试验分析找到暗培养的最佳时间。在玉米成熟胚诱导时发现，暗培养可以显著减轻褐变的发生，但要有效控制褐变还应该结合其他的方法[20]。李树丽[21]以中华红叶杨茎段为外植体，研究了光照条件对褐变的影响，结果表明，培养初期进行暗培养能有效降低褐变率，以暗培养10 d为宜，而光照强度1 000～3 000 lx对褐变率的影响不大；许传俊等[15]的试验也表明，光照强度增加会导致外植体褐变加剧。

②培养温度 李树丽[21]的研究表明，温度对褐变也有影响，在一定范围内褐变程度与温度呈正相关，即一定范围内，随温度升高各种酶的活性增强，促进了褐变。雷攀登等[22]也曾报道，温度是影响茶树腋芽褐变程度的重要因素，低起始培养温度可有效减轻褐变。

③培养方式 一般认为，用液体培养基培养可有效减轻褐变，以滤纸辅助效果更好。因为液体培养有利于外溢的酚类物质扩散，从而减少了褐变的发生，而滤纸对有毒物质有一定的吸附作用。从几种培养方式的褐变控制情况进行比较发现，纸桥培养最好，液体培养基次之，固体培养基最不利于控制褐变，许传俊等[15]证实了这一观点。但进一步研究时发现，当培养基几乎呈液体状态时红掌外植体最易褐变，愈伤诱导率最低。在一定范围内，随培养基硬度增大褐变程度得到了缓解，当硬度增大到一定程度时褐变率又上升。分析认为，培养基硬度增大控制了酚类物质的外溢，且硬度过大时有毒物质不易扩散，造成局部积累，从而加剧了褐变程度[23]。

3 控制褐变的方法

3.1 选择适宜的外植体

一般应选择生长旺盛的组织或器官，外植体接种时也可以选择剥去鳞片和大叶片，以切取幼嫩茎尖或顶芽分生组织接种较为理想。林丽媛等[24]以山鸡椒叶片和茎段为材料，在相同条件下诱导愈伤组织发现茎段培养不易发生褐变。夏铭等[25]的试验发现，处于旺盛生长季节的幼嫩茎段是优良的外植体，其愈伤组织发生率高、增殖快、褐变程度轻。

3.2 对材料进行预处理

①热激处理 最新的植物褐变研究发现，适度的热激处理可以降低组织褐变程度。赵滢等[26]研究了热激处理对蝴蝶兰叶片外植体组织培养褐变程度、外植体内酚类物质及活性氧代谢相关生理指标的影响，发现经热激处理后外植体组织培养褐变程度明显减轻，总酚含量、苯丙氨酸解氨酶（PAL）及多酚氧化酶（PPO）活性降低，但对过氧化物酶（POD）活性的抑制效果不明显，说明热激处理通过降低PAL及PPO活性，抑制了酚类物质的合成及氧化，且热激处理在短时间内提高了超氧化物歧化酶（SOD）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）的活性，进而减少丙二醛（MDA）和过氧化氢（H2O2）的产生，保护了细胞膜结构的完整性，最终有效抑制褐变发生。

②低温或黑暗条件下预培养 初期进行暗培养（2周左右）可在一定程度上减轻褐变程度[25]；王小娟等[27]研究了不同光照条件对鱼腥草外植体褐化程度的影响，发现全日照时外植体极易褐变，培养初期暗培养可以有效降低褐变率。

3.3 选择最佳培养基

张桂芳等[28]对佛手组培中褐变控制方法的探讨发现，适宜的培养基组分和抗褐变剂能明显减轻佛手组织培养中的褐变，提高组织培养成功率，初步建立了佛手组织培养体系；夏铭等[25]的试验表明，适宜的培养基（MS+ZT 0.5 mg/L+NAA 10.0 mg/L+GA32.0 mg/L+2%蔗糖）对减轻褐变是很有利的。

3.4 添加抗氧化剂和吸附剂

在培养基中添加抗氧化剂和吸附剂等抗褐变剂是组织培养中较常用的控制褐变的方法，前者抑制多酚氧化，后者吸附氧化物，从而减轻对组织培养物的毒害。常见的抗氧化剂和吸附剂有抗坏血酸（VC）、硝酸银、柠檬酸、硫代硫酸钠、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、活性炭（AC）等。

王蕾等[29]在建立番茄离体再生体系时发现，在诱导愈伤组织和不定芽时，在培养基中添加0.2 g/L或0.6 g/L AC或10 mg/L VC可有效减轻褐化；林丽媛等[24]在诱导山鸡椒愈伤组织时也发现添加适宜浓度的VC可以减轻褐变，且效果比AgNO3、AC、PVP都要好。康德贤等[18]发现，在培养基中添加AC、VC、PVP时防褐变效果依次增强。L-半胱氨酸和AgNO3可明显减轻大豆外植体的褐化[9]。韩美丽等[30]以木薯试管苗的顶端叶片为材料进行培养，发现在继代培养基中添加PVP在减小褐变率的同时可以提高愈伤组织的增殖率。Qu等[31]研究表明，用抗褐化剂溶液直接浸泡外植体，也可有效抑制褐变。

3.5 其他

通过连续转移外植体至新鲜培养基和加金属螯合剂也可减轻褐变，连续转移减轻了醌类物质对外植体的毒害作用，在一定程度上控制了褐变[32，33]。研究表明，PPO是一种含铜类蛋白质，而金属螯合剂可以和Cu2+螯合，使氧化酶失活，从而减轻褐变。夏铭等[25]证实，金属螯合剂对褐变有抑制作用。

4 结语

在具体试验研究中，因外植体基因型、培养条件、培养目的的不同，采用的防褐变措施、效果也不同，应借鉴前人经验摸索适合的防褐变方法，而且还要注意到各措施的局限性，例如不同植物所适宜的抗氧化剂和吸附剂的种类和浓度有很大差异；活性炭可以有效吸收培养基中的有害物质，但是它的吸收没有选择性，若吸收了培养基中的营养物质，则不利于愈伤组织的分化；抗氧化剂的加入会增加污染率；连续转移不利于愈伤组织的分化和生长；金属螯合物在使多酚氧化酶失活的同时也螯合了部分 Ca2+、Mg2+、Zn2+，影响其他有利酶的活性；热激处理对组织的活力有较大的损伤[25]；初期暗培养可以降低褐化率，但是暗培养时间不宜过长，以7 d为最佳，否则愈伤组织呈现灰白化[29]。所以，在实际应用中我们应根据培养的实际情况选择不同的方法，或者以多种方法相辅助，提高蔬菜愈伤组织诱导率和组织培养成功率。

[1]许传俊，李玲，李红，等.蝴蝶兰褐变外植体的显微结构观察及褐变成分的初步分析[J].园艺学报，2005，32（6）：1 111-1 113.

[2]谭文澄，戴策刚.观赏植物组织培养技术[M].北京：中国林业出版社，1997：238.

[3]王蒂.植物组织培养实验指导[M].北京：中国农业出版社，2010：7-8.

[4]李佳，赵文龙，周长艳，等.莲藕愈伤组织诱导及组织学观察[J].湖北农业科学，2014，53（3）：701-703，717.

[5]Mayer M,Harel E.Polyphenol oxidases in plants[J].Phytochemistry,1979,18:173-215.

[6]Kahn V.Some biochemical properties of polyphenol oxidase from two avocado varieties differing in their browning rate[J].Food Sci,1977,42:38-43.

[7]吕颖颖，李博，江大龙，等.影响玉米幼胚组织培养褐化因素的研究[J].种子，2014，33（1）：65-67.

[8]宋钦虎，郭新梅，裴玉贺，等.抑制玉米幼胚愈伤组织褐化的研究[J].农学学报，2012，2（5）：24-28.

[9]李海燕，刘淼，武小霞，等.大豆转化过程中的褐化现象研究[J].作物杂志，2010（1）：33-36.

[10]Yu D H,Meredith C P．The influence of explant origin on tissue browning and shoot production in shoot tip cultures of grapevine[J]．J Amer Soc Hort Sci,1986,111（6）:972-975.

[11]李然红，于丽杰，李晓东.甘蓝组织培养中防止外植体褐化的研究[J].北方园艺，2009（11）：96-99.

[12]Bonga J M，Durzan D J，著.阙国宁，译.树木组织培养[M].北京：中国林业出版社，1988：25-26.

[13]Reuveni O,Lilien-Kipnis H.Studies of thein vitroculture of date plam（Phoenix dactyliferaL.）tissues and organs[J].Volcani Institute of Agricultural Research,1974（145）:20.

[14]庾韦花，蒙平，张向军，等.牛尾菜组织培养中外植体褐变现象控制研究[J].广西农业科学，2010（12）：1 262-1 265.

[15]许传俊，李玲.几种培养基及光照对蝴蝶兰叶片外植体褐变的影响[J].亚热带植物科学，2006，35（1）：9-12.

[16]蒋燕，王进涛，袁红.激素配比对辣椒叶片愈伤组织诱导和不定芽分化的影响[J].北方园艺，2013（14）：118-120.

[17]杨海芸，吴震，王广东，等.不同培养条件对蝴蝶兰离体叶片不定芽发生的影响[J].南京农业大学学报，2007（1）：44-49.

[18]康德贤，王益奎，王红，等.辣椒不育系子叶愈伤诱导过程中减少褐化的研究[J].西南农业学报，2014（5）：2 066-2 070.

[19]Degl＇Innocenti E,Pardossi A,Tognoni F,et al.Physiological basis of sensitivity to enzymatic browning in ＇lettuce＇,＇escarole＇and ＇rocket salad＇when stored as fresh-cut products[J].Food Chem,2007,104:209-215.

[20]肖莉杰，王丽艳，闵丽，等.玉米成熟胚愈伤组织诱导及褐化控制研究[J].玉米科学，2011（4）：37-42.

[21]李树丽.温度及光照条件对中华红叶杨外植体褐变的影响[J].北方园艺，2014（4）：94-96.

[22]雷攀登，吴琼，徐奕鼎，等.茶树腋芽离体培养中的褐化控制研究[J].中国农学通报，2012（7）：190-193.

[23]杜敬然，赵斌，李英丽，等.红掌组织培养过程中外植体褐变的研究[J].北方园艺，2010（9）：160-162.

[24]林丽媛，韩小娇，陈益存，等.山鸡椒的愈伤组织诱导及植株再生[J].植物生理学报，2013，49（10）：1 047-1 052.

[25]夏铭，吴绛云.红豆杉组织培养中褐变问题的研究[J].生物技术，1996，6（3）：18-20.

[26]赵滢，杨树华，李秋香，等.热激处理对蝴蝶兰组培褐变的抑制及其生理机制[J].北京林业大学学报，2013，35（1）：103-108.

[27]王小娟，袁艺，杨俊杰，等.鱼腥草愈伤组织诱导及褐化抑制的研究[J].安徽农业大学学报，2009，36（4）：585-588.

[28]张桂芳，刘军民，关杰敏，等.佛手组织培养中褐变控制研究[J].中药材，2010，33（6）：857-859.

[29]王蕾，宿烽.番茄离体再生系统的建立及褐化现象调控研究[J].山东农业科学，2014（3）：9-12，16.

[30]韩美丽，陆荣生，霍秀娟，等.木薯叶片愈伤组织诱导与分化影响因子研究[J].江西农业学报，2012，24（6）：1-4，17.

[31]Qu R,Chaudhury A.Improved young inflorescence culture and regeneration of ＇Tifway＇bermudagrass （Cynodon transvaalensis×C.dactylon）[J].International Turfgrass Society,2001,9:198-201.

[32]Duan J X,Chen H,Yazawa S.In vitropropagation ofPhalaenopsisvia culture of cytokinin-induced nodes[J].J Plant Growth Regul,1996（15）:133-137.

[33]Ernst R.Effect of thidiazuron on in vitro propagation ofPhalaenopsisandDoritaenopsis（Orchidaceae）[J].Plant Cell Tiss Org,1994,39:273-275.