高效液相色谱-串联质谱法同时测定马鞭草中5种糖苷类成分的含量

王 华，任 非，段坤峰，陈学军，袁志芳

(1. 河北医科大学第三医院，河北 石家庄 050051；2. 河北医科大学第二医院，河北 石家庄 050000；3. 河北医科大学药学院，河北 石家庄 050017)

高效液相色谱-串联质谱法同时测定马鞭草中5种糖苷类成分的含量

王 华1，任 非2，段坤峰1，陈学军1，袁志芳3

(1. 河北医科大学第三医院，河北 石家庄 050051；2. 河北医科大学第二医院，河北 石家庄 050000；3. 河北医科大学药学院，河北 石家庄 050017)

目的 建立高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法同时测定马鞭草中桃叶珊瑚苷、戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、龙胆苦苷、毛蕊花糖苷的含量。方法 色谱柱采用Waters SunfireTMC18(4.6 mm×150 mm,5 μm)，流动相为乙腈-0.1%甲酸水(25∶75→40∶60)，梯度洗脱，流速0.8 mL/min，进样量5 μL，柱温30 ℃；采用电喷雾离子源(ESI)，以多反应监测方式(MRM)进行定量分析。桃叶珊瑚苷、戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、龙胆苦苷在正离子电离模式下定量分析离子对分别为m/z 167.2→m/z 149.1、m/z 243.2→m/z 225.2、m/z 227.2→m/z 195.2、m/z 195.2→m/z 177.2。毛蕊花糖苷在负离子电离模式下定量分析离子对为m/z 461.3→m/z 161.0。结果 桃叶珊瑚苷、戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、龙胆苦苷、毛蕊花糖苷五种组分在120～1 200,10 000～100 000,5 000～50 000,1.2～12,510～5 100 μg/L的浓度范围内与峰面积均呈良好的线性关系，平均回收率分别为101.2%，98.63%，99.45%，101.6%，100.3%。结论 本法操作简便、准确、具有良好的重现性, 为马鞭草药材的合理应用及质量控制奠定了基础。

高效液相色谱-串联质谱；桃叶珊瑚苷；戟叶马鞭草苷；马鞭草苷；龙胆苦苷；毛蕊花糖苷；马鞭草

马鞭草为马鞭草科植物马鞭草的干燥地上部分，收载于中国药典2010版一部。具有活血散瘀、截疟、解毒、利水消肿等功效[1]。药典收载的马鞭草是利用其脂溶性成分熊果酸作为鉴别和含量测定指标的，而马鞭草基本上采用水提和醇提工艺。因此，研究马鞭草极性成分能够更好地监控药材的质量。另外，中药材的定量方法多是该药材中具有一定药理活性的有效成分，本实验小组先前对马鞭草不同提取物的镇咳、抗炎和祛痰作用进行了系统的药效学研究[2]，结果表明马鞭草醇提物的正丁醇部分和醋酸乙酯部分为镇咳作用的有效部位，此后又对这两部分的化学成分进行了研究[3]，发现桃叶珊瑚苷、戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、龙胆苦苷、毛蕊花糖苷含量最高，是马鞭草的主要活性成分，适合作为马鞭草药材的指标性成分。因此，同时检测马鞭草中这5个糖苷类极性成分的含量对于马鞭草药效物质基础研究和质量控制都具有重要意义。本实验小组采用HPLC-MS/MS法测定取得了满意的结果，现报道如下。

1 材 料

1.1仪器 Applied Biosystems 3200 QTRAP高效液相色谱-串联质谱仪(美国应用生物系统公司，配有三重四级杆带线性离子阱和电喷雾离子源ESI，analyst 1.4.2 software工作站)；Agilent1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司，包含G1322A型脱气机，G1311A型四元泵，G1329A型自动进样器，G1316A型柱温箱，G1314B型紫外检测器)。

1.2试药 桃叶珊瑚苷、毛蕊花糖苷、龙胆苦苷对照品(批号分别为111761-200601，111530-200706，110770-200611)均购自中国食品药品检定研究院；马鞭草苷、戟叶马鞭草苷为自制产品(经柱色谱分离，且经IR、MS、1H-NMR、13C-NMR确定结构[4-5]，质量分数大于98.5%。)；马鞭草药材购自石家庄乐仁堂药店及不同产地的药业公司，经河北药科大学药学院生药学教研室聂凤褆教授鉴定。马鞭草药材经40 ℃干燥后，粉碎过24目筛，备用。甲醇、甲酸均为色谱纯(美国迪马公司)，水为注射用水，其余试剂均为分析纯试剂。

2 方 法

2.1溶液的制备

2.1.1供试品溶液 取药材粉末约0.5 g，精密称定，置具塞100 mL锥形瓶中，加入20 mL 80%甲醇，密塞，称定质量，超声处理45 min，放冷，称质量，用80%甲醇补充减失的质量，摇匀，微孔滤膜滤过，取续滤液备用，即得。

2.1.2对照品溶液 分别精密称取5种糖苷类化合物对照品适量，加80%甲醇溶解并稀释制成含桃叶珊瑚苷1.2 mg/L、戟叶马鞭草苷100.0 mg/L、马鞭草苷50.0 mg/L、龙胆苦苷12 μg/L、毛蕊花糖苷5.1 mg/L的混合溶液，即得。

2.2色谱与质谱条件

2.2.1色谱条件 色谱柱： Waters SunfireTMC18(4.6 mm×150 mm, 5 μm)；流动相：乙腈-0.1%甲酸水(25∶75→40∶60,0→6 min)，梯度洗脱；流速0.8 mL/min；进样量5 μL；柱温30 ℃。

2.2.2质谱条件 采用正负离子电喷雾离子源(ESI)，选取灵敏度好的离子模式。采用多反应监测方式(MRM)进行质谱扫描定量分析。通过离子去簇电位(DP)、入口电位(EP)和碰撞能量电位(CE)的优化，选取响应值高的质谱条件。正离子电离模式：离子喷雾电压5 500 V，离子源温度650 ℃，离子源气体1(GS1，N2)压力400 kPa，离子源气体2(GS2，N2)压力450 kPa，气帘气体(CUR，N2)压力137 kPa，碰撞气(CAD)Medium。负离子电离模式：离子喷雾电压-4 500 V，离子源温度650 ℃，离子源气体1(GS1，N2)压力400 kPa，离子源气体2(GS2，N2)压力450 kPa，气帘气体(CUR，N2)压力137 kPa，碰撞气(CAD)Medium。

3 结 果

离子检测的筛选参数见表1。对照品溶液的离子扫描质谱图见图1～5。

4 方法学考察

表1 马鞭草离子检测的筛选

4.1标准曲线的制备 精密吸取“2.1.2”项下的对照品溶液1.0，3.0，5.0，7.0，10.0 mL，置于10 mL量瓶中，用80%甲醇稀释至刻度，摇匀，按选定的色谱条件测定峰面积。以对照品质量浓度X(mg/L)为横坐标，相应的峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，线性关系良好。见表2。

4.2定量限 分别精密吸取各对照品储备液适量，加甲醇溶解，并逐渐稀释至信噪比S/N≥10时，即为定量限。见表2。

4.3重复性试验 取同一批药材粉末，精密称取6份，按“2.1.1”项下方法分别平行制备6份供试品溶液，按选定的色谱条件测定。结果桃叶珊瑚苷、戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、龙胆苦苷、毛蕊花糖苷峰面积的RSD分别为1.3%，1.6%，1.8%， 1.7%，1.9%，说明重复性良好。

4.4精密度试验 取马鞭草药材粉末，按“2.1.1”项下方法制备1份供试品溶液，按选定的色谱条件连续重复进样6次。结果桃叶珊瑚苷、戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、龙胆苦苷、毛蕊花糖苷峰面积的RSD分别为1.2%，1.5%，1.3%， 1.9%，1.8%，说明精密度良好。

图1 桃叶珊瑚苷离子扫描质谱图

图2 戟叶马鞭草苷离子扫描质谱图

图3 马鞭草苷离子扫描质谱图

图4 龙胆苦苷离子扫描质谱图

图5 毛蕊花糖苷离子扫描质谱图

表2 5种糖苷类化合物的标准曲线

4.5稳定性试验 精密吸取同一供试品试液，在室温下放置，分别于0，2，4，6，8，10，12，24 h测定5种糖苷类化合物的质量浓度。结果桃叶珊瑚苷、戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、龙胆苦苷、毛蕊花糖苷质量变化的RSD分别为1.9%，1.3%，1.7%，1.8%，1.2%，说明样品溶液在24 h内基本稳定。

4.6回收率试验 精密称取6份已知5种糖苷类化合物质量浓度的药材粉末0.25 g，依次加入按“2.1.2”项下方法制备的混合对照品溶液17 mL及80%甲醇3 mL，按“2.1.1”项下方法操作，按选定的色谱条件测定。结果桃叶珊瑚苷、戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、龙胆苦苷、毛蕊花糖苷的平均回收率分别为101.2%，98.63%，99.45%，101.6%，100.3%，RSD分别为1.3%，1.5%，0.8%，1.7%，1.2%(n=6)。

5 样品测定

取不同来源马鞭草药材粉末各0.50 g，精密称定，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，按选定的色谱条件测定，以外标法计算桃叶珊瑚苷、戟叶马鞭草苷、马鞭草苷、龙胆苦苷、毛蕊花糖苷的质量。见表3。

表3 不同来源马鞭草药材中5种糖苷类化合物的含量(n=3，mg/g)

6 讨 论

马鞭草药源丰富、廉价易得，具有多种药理活性，治疗范围广泛，尤其在神经保护方面，其作用机制更是多靶点、多环节、多途径的，对防治老年痴呆、帕金森氏病等神经退行性病变具有很好的疗效。另外，在镇咳和抗动脉粥样硬化方面也有确切的疗效。近几年来，本实验小组一直致力于马鞭草的研究，先前在应用HPLC法测定马鞭草中戟叶马鞭草苷和马鞭草苷[6]的过程中，也尝试过HPLC法测定5种糖苷的含量，但未获成功，可能是由于仪器的灵敏度限制所致。

本实验选定用20倍80%甲醇超声处理45 min来制备样品，是因为先前对不同浓度(20%，40%，60%，80%及100%)甲醇的提取率、不同超声提取时间(15，30，45，60 min)以及超声处理和回流提取两种方式等进行了比较，从而采取的最佳方法。

样品的检测结果表明，各产地药材5种糖苷的含量差异较大，本实验首次建立同时测定马鞭草中5种糖苷含量的方法，为科学评价与有效控制马鞭草药材质量提供了新手段。该方法操作简便、准确可靠、灵敏度高、重复性好，可作为马鞭草药材的鉴别和质量控制方法。

[1] 中国药典委员会. 中国药典(一部)[S]. 北京：中国医药科技出版社，2010：49

[2] 任非，袁志芳，段坤峰，等. 马鞭草提取物的镇咳、抗炎和祛痰作用研究[J]. 中国药房，2013，24(31)： 2887-2890

[3] 任非，段坤峰，付颖，等. 马鞭草镇咳有效部位化学成分的研究[J]. 中国医院药学杂志， 2013，33(6)：445-449

[4] Teborg D，Junior P. Iridoid glucosides from penstemon nitidus[J]. Planta Med，1991，57(2)：184-186

[5] 张涛，阮金兰，吕子敏. 马鞭草环烯醚萜苷类成分的研究[J]. 中草药，2000，31(10)：721-723

[6] 袁志芳，段坤峰，张兰桐，等. HPLC法同时测定马鞭草中马鞭草苷和戟叶马鞭草苷[J]. 中草药，2009，40(5)：818-820

Simultaneous determination of five glycosides in Verbena Officinalis L. by HPLC-MS/MS

WANG Hua1, REN Fei2, DUAN Kunfeng1, CHEN Xuejun1, YUAN Zhifang3

(1.The Third Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050051, Hebei, China; 2.The Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, Hebei, China; 3.Pharmacy School of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, Hebei, China)

Objective It is to establish a HPLC-MS/MS method for the simultaneous determination of aucubin, hastatoside, verbenalin, gentiopicroside and verbascoside in Verbena officinalis L. Methods All separations were carried out on a Waters SunfireTM C18 column (4.6mm×150mm, 5μm) with the mixture of acetonitrile-water containing 0.1% formic acid (25∶75→40∶60) as mobile phase by gradient elution at the flow rate of 0.8 mL/min and injection volume was 5 μL. The temperature of column was 30℃. Detection was performed with multiple reactions monitoring (MRM) by using electrospray ionization (ESI) source. The production transitions were monitored at m/z 167.2→m/z 149.1, m/z 243.2→m/z 225.2, m/z 227.2→m/z 195.2, m/z 195.2→m/z 177.2 (ESI+ mode) for aucubin, hastatoside, verbenalin, gentiopicroside and m/z 461.3→m/z 161.0 (ESI-mode) for verbascoside. Results The linearity was good for aucubin, hastatoside, verbenalin, gentiopicroside and verbascoside in the range of 120-1 200, 10 000-100 000, 5 000-50 000, 1.2-12, 510-5 100 ng/mL. The average recoveries were 101.2%, 98.63%, 99.45%, 101.6% and 100.3% respectively. Conclusion This method is simple, accurate and reproducible. It can set the basis for reasonable application and quality control for Verbena Officinalis L.

HPLC-MS/MS; aucubin; hastatoside; verbenalin; gentiopicroside; verbascoside; Verbena Officinalis L.

王华，女，主管药师，研究方向为药物质量控制。

任非，副主任药师，E-mail:renfei680811@sina.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.03.003

R969.4

A

1008-8849(2015)03-0235-04

2013-10-30