粗球孢子菌病原学鉴定及形态学参数分析

国九英，秦 铮，樊 华，安春丽

粗球孢子菌病原学鉴定及形态学参数分析

国九英1，秦 铮2，樊 华1，安春丽1

目的 建立粗球孢子菌的形态学参数并对相关数据进行分析，为粗球孢子菌病原学鉴定提供数字化资料。方法 取粗球孢子菌肺感染患者痰液进行巴氏染色，应用显微镜摄像系统采集粗球孢子菌图像，通过计算机数字图像分析系统测量粗球孢子菌的长径，短径，周长，面积，计算其圆球度等一系列形态学参数。应用SPSS数据处理软件对采集到的数据进行统计学分析。结果 测量粗球孢子菌297个，长径均值为70.91 μm，最大值为110 μm，最小值为33 μm；短径均值为54.46 μm，最大值为92 μm，最小值为27 μm；周长最大值为382 μm，最小值 116 μm，平均值为227.60 μm；面积最大值85.93 mm2，最小值8.49 mm2，平均值为30.75 mm2。结论 利用计算机数字图像分析系统和SPSS数据处理软件获得粗球孢子菌长径、短径、周长、面积、圆球度等的累加、均值、标准差、最大值、最小值及95%可信区间等一系列形态学参数。粗球孢子菌形态学参数和数据的建立为量化及鉴别该菌提供了可靠的资料。

粗球孢子菌；形态学参数；数字图像分析

粗球孢子菌(Coccidioidesimmitis)是一种深部感染真菌，为双相菌属。在自然界中通常以菌丝型存在，分隔成段，形成有传染性的关节孢子，称为关节菌丝型；而在人及动物组织内则形成球形厚壁，产生许多内生孢子，称为孢子型；有时二者可互相转化[1]。粗球孢子菌主要存在于土壤、空气、水、动物皮毛和粪便中，通过呼吸道、消化道、粘膜及伤口侵入机体。这种真菌所致的球孢子菌病(Coccidioidomycosis)主要流行于美国西南部的半干旱地区，在我国较为少见[2]。多数原发性球孢子菌感染局限于肺脏，常表现为轻度的自限性呼吸道感染。少数病例形成播散性致死性全身感染，预后不佳[3]。肺部感染的粗球孢子菌形态及大小已有一些描述，但各家报道的大小不尽一致。数字图像处理技术(digital image processing) 可以对显微镜下微小物体进行客观、精确地测定，可灵活、大量地获得形态学相关信息，且因具有快速、简捷易操作等优点而倍受关注[4]。近年来,数字图像处理技术已被用于寄生虫学领域的研究中[5]。本实验采用数字图像分析技术分析引起肺感染的粗球孢子菌的形态学特征,旨在为粗球孢子菌病原学的研究提供更加准确的形态学参数。

1 材料和方法

1.1 粗球孢子菌来源及标本处理 收集一位确诊为肺球孢子菌病患者的痰液。用灭菌的接种环沾取患者痰液与少许生理盐水混匀，涂于载玻片上，形成直径约为1 cm左右的薄膜，自然干燥后，95%乙醇固定，采用巴氏染色(PapanicoiauStain)方法对标本进行染色，封片后显微镜下观察。

1.2 图像采集及形态学参数测量 显微镜下观察粗球孢子菌包囊，选取背景清晰，包囊数量多的视野，经摄像系统采集粗球孢子菌包囊的图像。使用MetaMorph/DP10/BX41数字图像处理系统测量采集到的包囊的长径、短径、周长、面积等参数。计算出包囊的体积、等效直径及圆球度[6]。

1.3 统计分析 利用SPSS 19.0数据处理软件对相关数据进行统计分析。

2 结 果

痰液中的粗球孢子菌经巴氏染色后，孢子体呈褐色、圆形或近圆形，具有较厚的孢子壁，含内生孢子(图1)。从不同视野中共采集了297个形态完整的孢子体，测量各项指标的数据，进行统计分析，结果见表1。孢子体长径数据的分布情况如图2和表

1所示。孢子体长径最大值为110 μm，最小值为33 μm，平均值为70.91μm。其中55.89%(166/297)的孢子体长径主要分布于60～84 μm之间。孢子体短径数据的分布情况如图3所示。其中53.20%(158/297)的孢子体的短径在48～68 μm之间，短径的最大值为92 μm，最小值为27 μm，平均值为54.46μm；孢子体周长数据的分布情况见图4。其中61.28%(182/297)孢子体的周长在197～278 μm之间，其最大值为382 μm，最小值 116 μm，平均值为227.60 μm；孢子囊的面积数据分布情况如图5所示。64.98%的孢子体面积在17～40 μm之间(193/297)，最大值85.93 mm2，最小值8.49 mm2，平均值为30.75 mm2。孢子体的圆球度均值为0.67，最大值为1，最小值为0.30。

图1 痰涂片标本中的粗球孢子菌孢子体(巴氏染色，200×)

Fig.1 Spherules ofCoccidioidesimmitisin sputum (Papanicoiaustain, 200×)

表1 297个粗球孢子菌孢子体的相关测量数据

图2 粗球孢子菌孢子体长径的数据分布

Fig.2 Distribution ofCoccidioidesimmitiswith the long diameter in spherules

图3 粗球孢子菌孢子体短径的数据分布

Fig.3 Distribution of the short diameter in spherules ofCoccidioidesimmitis

图4 粗球孢子菌孢子体周长的数据分布

Fig.4 Distribution of the perimeter inCoccidioidesimmitisspherules

图5 粗球孢子菌孢子体面积的数据分布

Fig.5 Distribution of the area inCoccidioidesimmitisspherules

3 讨 论

本实验采用计算机数据图像分析技术对球孢子

菌病患者痰液中的粗球孢子菌进行形态学参数的测定及分析。测量了297个孢子体，其结果这与国内外文献中记载球孢子菌孢子体直径范围10～80 μm基本一致[8-9]。进一步说明数字图像处理技术在测量粗球孢子菌形态学参数的客观性。通过本次实验测量计算出粗球孢子菌的圆球度均值为0.67，最大值为1，最小值为0.13。圆球度反应的是非球形颗粒的形状与球形的差异，圆球度的值愈小，说明颗粒的形状与圆球的差异愈大。

我国为粗球孢子菌病的非流行区，临床上对该真菌缺乏了解，且不同的染色方法和携菌标本的不同更加大了认识该菌的难度，容易造成误诊，延误病情。数字图像处理技术可以对显微镜下微小物体进行客观、精确地测定，可灵活、大量地获得形态学相关信息，且因具有快速、简捷易操作等优点。国内外尚未见用此技术检测粗孢子菌的报道。本研究利用数字图像处理技术测量了粗球孢子菌。获得了其长径、短径面积、周长、等效直径、圆球度等一系列的精确数据，不仅补充了该菌的形态学资料，还为临床检验和诊断粗球孢子菌病提供了有意义的参考依据。

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Etiological identification and morphological parameters ofCoccidioidesimmitis

GUO Jiu-ying1,QIN Zheng2,FAN Hua1,AN Chun-li1

(1.DepartmentofPathogenBiology,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China;2.InstituteofRespiratoryDiseases,theFirstAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China)

In this study, we aimed to establish the morphological parameters ofCoccidioidesimmitis, providing digital data for the etiological identification. Taking sputum of theCoccidioidesimmitispulmonary infection patients for Papanicolaou staining, theCoccidioidesimmitisimages were obtained by computer photographic system, and the length, width, perimeter, and area ofCoccidioidesimmitiswere determined by computer digital image, and then the analysis of these dada were conducted by SPSS. It was found that when 297Coccidioidesimmitiswere measured, the average length, width, perimeter, and area were 70.91 μm, 54.46 μm, 227.60 μm, and 30.75 mm2, respectively. Meanwhile, the length of the maximum values was 110 μm, the width was 92 μm; the largest and least perimeters were 382 μm and 116 μm; and the areas were 85.93 mm2and 8.49 mm2. It seems that the set of morphological parameters provide reliable information for identifyingCoccidioidesimmitis.

Coccidioidesimmitis; morphological parameters; digital image analysis

An Chun-li, Email:cmucl@126.com

国家自然科学基金(No.81370189)

安春丽，Email：cmucl@126.com

1.中国医科大学基础医学院病原生物教研室，沈阳 110122； 2.中国医科大学附属一院呼吸疾病研究所，沈阳 110001

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.02.004

R382

A

1002-2694(2015)02-0113-03

2014-08-25；

2014-11-26

Supported by the National Natural Science Foundation of China(No. 81370189)