miR－146a在大鼠神经病理性疼痛模型中的表达及其作用机制

王之遥，申 乐，赵 欣，黄宇光

(中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院麻醉科，北京100730)

神经病理性疼痛(neuropathic pain，NP)是一种最难治疗的疼痛综合征，目前全球有数百万患者深受神经病理性疼痛的困扰，严重影响其日常活动和生活质量，而相应的治疗手段也不尽如人意。这可能因为神经病理性疼痛的发病病因尚不明确，潜在的病理生理机制十分复杂，且神经病理性疼痛的初级治疗没有被认可或目前尚未找到最优化的药物进行治疗等［1－2］。

microRNAs(miRNAs)是一类仅有约22 个核苷酸序列组成的内源性非编码单链RNA，其作为“基因表达调控的开关”主要在转录后水平发挥作用，主要参与调节自主免疫、细胞分化、炎性反应及慢性疼痛等过程［3］。近年来，microRNAs 在神经病理性疼痛中的作用也越来越受到学者的关注，北京协和医院麻醉科黄宇光教授课题组前期研究也进一步证实microRNAs 在神经病理性疼痛中的表达发生改变［4］。miRNA－146a 通过调控其靶基因IL－1 相关蛋白激酶(interleukin－1 receptor－associated kinase，IRAK)和肿瘤坏死因子受体活化因子6(TNF receptor－associated factor 6，TRAF6)而发挥作用，而IRAK1 和TRAF6 又是Toll受体(toll－like receptor 4，TLR4)信号传导通路的两个重要接头蛋白［5］。多项研究已经证实TLR4 信号传导通路活化释放炎性因子，与慢性疼痛的关系尤为密切［6－8］。目前认为miR－146a 作为一种免疫调节分子参与了肿瘤发生及炎性反应发展过程［9－10］，但其是否调节其靶基因IRAK1 和TRAF6 参与神经病理性疼痛尚无相关研究报道。本实验旨在研究大鼠bCCI 模型中microRNA－146a 在神经病理性疼痛中的作用，及其调节IRAK1 和TRAF6 参与疼痛相关TLR4 信号传导通路的具体机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物和分组:SPF 级SD 雌性大鼠，体质量180～200 g［北京维通利华实验动物技术有限公司，经营许可证编号SCXK(京)200220043］，饲养于北京协和医院实验动物中心，室温22 ℃，相对湿度50%，明暗各12 h，环境适应期3 d。将36 只大鼠随机分成对照组、假手术组和bCCI 组，行大鼠双侧坐骨神经结扎手术。手术均由同一人操作，对侧同样。本研究实验方案经中国医学科学院北京协和医院动物伦理委员会审核批准。分别于手术建模前1 d及术后第1、3、7 和14 天进行动物行为学检测。每只大鼠左右后足各重复测量3 次，测量间隔为5 min，3次测量读数取平均值。

1.1.2 试剂:检测miR－146a 和内参U6 表达的引物(广州锐博生物科技有限公司)。反转录及染料法实时定量PCR 试剂盒(Takara 公司)。IRAK1、TRAF6 和β－actin 抗体(Santa Cruze 公司)，所有二抗(中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 机械刺激诱发痛测量:将大鼠摆放在安静环境中适应15 min，用电子Von Frey 刺激针垂直分别刺激大鼠左右后足底，产生抬足反射的最小刺激强度为机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold，MWT)。测量3 次，取平均值。

1.2.2 热刺激诱发痛测量:分别热辐射大鼠左右后足底，其快速抬足或者舔足即刻停止，记录辐射持续时间即缩足反射潜伏期(paw withdrawal thermal latency，PWTL)。记录3 次，取平均值。

取材:建模后第14 天将大鼠麻醉后断头法处死，迅速暴露脊髓，切除L4－6 背根神经节，立即放入液氮冷却，－80 ℃冻存。

1.2.3 实时定量PCR 检测miR－146a 及IRAK1、TRAF6 的表达:Trizol 法提取总RNA，紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳分别测量RNA 浓度与质量，A260/A280值在1.8～2.1 之间的RNA 样本方可使用。利用反转录试剂盒按照说明将RNA 样本反转录为cDNA。目的基因选用β－actin 作为内参基因，miR－146a 检测选用miRNA 特异性引物，U6 为内参分析。所使用引物序列见表1。按照说明书加样cDNA 实时定量PCR，每个样品3 个重复孔。Applied Biosystems Step－One Plus 行qPCR 反应。根据熔解曲线确定引物特异性，采用2－ΔΔct法计算基因相对表达量。

表1 Real-time PCR 目的基因引物序列Table 1 Primer set list for mRNAs

1.2.4 Western blot 检测IRAK1 和TRAF6 蛋白表达:冰上破碎组织加入RIPA(单去污剂)裂解液(含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)匀浆，BCA 法酶标仪测定组织蛋白浓度。按照目的蛋白分子大小选择8%或10%分离胶，取30 μg 样品上样，彩染蛋白相对分子质量指示标准SDS－PAGE 胶(10 cm ×10 cm)。80 V 恒压30 min 后改为120 V 恒压直至蛋白指示剂移动至分离胶底部。300 mA 恒流电转75 min，5% 脱脂牛奶室温封闭1 h。兔抗小鼠IRAK1抗体(1∶100)、兔抗小鼠TRAF6 抗体(1∶100)4 ℃孵育过夜。TBST 洗涤3 次，二抗室温孵育1 h。ImageQuant LAS4000 mini ECL 曝光。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0 和GraphPad Prism 5.0 软件进行数据分析。定量资料数据采用均值±标准差(±s)表示，两组之间比较采用t 检验;多组之间比较采用单因素方差分析(One－way analysis of variance，ANOVAs)。

2 结果

2.1 大鼠行为学改变

2.1.1 大鼠机械刺激缩足反射阈值(MWT):术后第1 天开始至14 天，bCCI 组大鼠双后足MWT 较术前及假手术组、naïve 组大鼠显著下降(P＜0.05)，术后第14 天最低(图1)。

2.1.2 大鼠热刺激缩足反射潜伏期(PWTL):术后第1 天开始至14 天，bCCI 组大鼠双后足PWTL 较术前及假手术组、正常对照组大鼠显著下降(P＜0.05)，术后第14 天最低(图2)。

图1 bCCI 组、sham 组及naïve 组大鼠双后足机械刺激行为学变化趋势Fig 1 Nociceptive threshold of rats in three groups to mechanic stimulation was evaluated before bCCI surgery and at different post-operative timepoints(±s，n=6)

图2 bCCI 组、sham 组及naïve 组大鼠双后足热刺激行为学变化趋势Fig 2 Nociceptive threshold of rats in three groups to thermal stimulation was evaluated before bCCI surgery and at different post-operative timepoints(±s，n=6)

2.2 实时定量qPCR 结果

建模术后第14 天，bCCI 组大鼠L4－6 背根神经节中miR－146a 表达显著下调(P＜0.05)(图3A)。miR－146a 靶基因IRAK1 及TRAF6 在mRNA 水平表达显著增加(P＜0.05)(图3B，C)。

2.3 Western blot 结果

术后第14 天，bCCI 组大鼠L4－6 背根神经节中IRAK1 及TRAF6 在蛋白水平表达显著上调(图4A)，与假手术组及naïve 组相比，IRAK1 表达升高1.5 倍(P＜0.05)(图4B)，TRAF6 表达增加2 倍(P＜0.05)(图4C)。

3 讨论

本实验首次检测神经病理性疼痛大鼠背根神经节中miR－146a 以及其靶基因IRAK1 和TRAF6 的表达变化，研究发现bCCI 大鼠背根神经节中miR－146a 显著下调，其靶基因IRAK1 和TRAF6 在mRNA 水平和蛋白水平表达均显著上升。

图3 miR-146a 及其靶基因IRAK1 和TRAF6 mRNA 变化Fig 3 Expression of miR-146a，IRAK1 and TRAF6 were determined in the L4-L6 dorsal root ganglions of three groups' rats on day 14 after surgery using real-time PCR(±s，n=6)

图4 术后第14 天各组大鼠L4-6 背根神经节中IRAK1 和TRAF6 蛋白水平变化Fig 4 Changes overtime of IRAK1 and TRAF6 protein level were determined in L4-6 dorsal root ganglions of bCCI rats on day 14 after surgery using Western blot(±s，n=6)

MicroRNAs 与神经病理性疼痛的发生密不可分，现已知多种miRNA 参与神经病理性疼痛。外周神经损伤，炎性因子释放，导致背根神经节中多种miRNA 表达发生差异，进一步引起其疼痛相关靶基因表达上调或者下调，从而增加背根神经节神经元兴奋性，最终导致中枢敏化，发生慢性疼痛，表现为痛觉过敏、疼痛异常［11］。本研究发现bCCI 大鼠行为学表现为机械疼痛阈值下降，第14天最低;热刺激疼痛阈值降低，第14 天尤为明显，这与先前研究结果相符［12］。本研究通过实时定量PCR 方法检测发现第14 天bCCI 大鼠背根神经节中miRNA－146a 表达显著下调。目前研究发现miRNA－146a 主要参与自主免疫调节、肿瘤发生及炎性反应发展过程［9］，有报道认为骨关节炎大鼠关节脊髓背角miR－146a 表达显著下调［13］，而另一项神经病理性疼痛大鼠实验结果显示坐骨神经结扎大鼠第7、14 天海马中miRNA－146 表达下调［14］。IRAK1 和TRAF6 是miRNA－146a 调控的主要两个靶基因，也是TLR4 信号传导通路中重要的蛋白分子，大量文献已经证实神经病理性疼痛中TLR4 信号传导通路激活。不仅如此，研究发现miR－146a 通过IRAK1和TRAF6 反馈调控TLR4 信号传导通路。本研究在mRNA 水平和蛋白水平均证实IRAK1 和TRAF6表达在第14 天bCCI 大鼠背根神经节表达上调，但是尚未研究bCCI 大鼠miRNA－146a 对TLR4 信号传导通路的反馈作用。研究表明给予miRNA－146a 激动剂可有效减少巨噬细胞释放炎性介质从而缓解肝脏缺血再灌注损伤［15］，然而在神经病理性疼痛治疗方面尚未见相关报道。因此，miRNA－146a 是否可作为有效治疗神经病理性疼痛的新靶点仍需进一步深入研究。

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