siRNA沉默Cdkl5对原代皮质神经元Mecp2及其下游靶基因表达的影响

杨文旭，潘 虹

(北京大学第一医院实验中心，北京100034)

细胞周期依赖性激酶样5 蛋白 (cyclin-dependent kinase-like 5，CDKL5)是丝氨酸/苏氨酸激酶9，近年发现其编码基因突变是引起不典型Rett 综合征(Rett syndrome，RTT)中的早发惊厥型的主要原因，约占50%以上［1］。RTT 是一种X连锁的主要累及女性并引起严重智力障碍的发育性神经遗传病。典型RTT 的主要致病基因是甲基化CpG 结合蛋白2 基因(methyl-CpG-binding protein 2，MECP2)。由于CDKL5 和MECP2 突变能引起相似的表型，如精神运动发育迟滞、手刻板动作和语言障碍等提示它们可能通过相同的分子通路发挥作用。

已确定的MeCP2 调控的下游靶基因包括NMDA 受体［2］、脑源性神经生长因子(brain devired neurophic factor，BDNF)［3］等。其中BDNF 表达量受MeCP2 磷酸化动态修饰调节的过程已经明确［4］。BDNF 是一种促进神经生长发育的营养因子，它广泛分布于中枢神经系统，在维持突触间信息传递以及突触可塑性等方面具有重要意义［5］。目前CDKL5的下游靶基因及协同蛋白研究较少，鼠模型中确认的只有神经元突触囊泡蛋白-1(amphiphysin1，Amph1)［6］和突触后致密蛋白-95(postsynaptic density protein-95，Psd95)［7］。鉴于两基因变异造成重叠的临床表现，提示CDKL5 与MeCP2 可能通过相同通路实现其在神经元内的功能。此外，由于CDKL5 缺乏可以导致神经元形态异常［8］，提示CDKL5 可能与凋亡相应通路息息相关。因此本实验用体外培养的孕18d 胎鼠皮质神经元，使用siRNA 技术敲低Cdkl5 从而建立稳定的体外模型，通过real-time PCR、Western blot、CCK8 实验分析该模型下游相关靶基因变化以及转染后神经元的活力以及凋亡状态。旨在为研究Cdkl5 的作用机制提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:SPF 级孕龄18 d SD 胎鼠由北京维通利华公司提供。动物实验通过北京大学动物实验伦理委员会同意，伦理编号:J201438。

1.1.2 药物及试剂:DMEM 培养基、Neurobasal 培养基、B-27、0.25%胰蛋白酶、L-谷氨酸盐和胎牛血清(Gibco 公司)，多聚赖氨酸(Sigma 公司)，Trizol(Ambion 公司)，RT-PCR 反转录试剂盒(Life 公司)SYBR® Green PCR 混合物(AB Applied Biosystems公司)，CDKL5 多克隆抗体、Mecp2 单克隆抗体和GAPDH 单克隆抗体(Abcam 公司)，cleaved caspase-3 多克隆抗体(Millipore 公司)，兔抗鼠IgG 二抗和鼠抗兔IgG 二抗(Santa Cruz 公司)，化学发光剂(Thermo 公司)，CCK-8(Dojindo 公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:胎鼠皮质神经元培养方法如前述［9］。用0.25%胰蛋白酶于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中消化摘取的胎鼠大脑皮质灰质部分。用DMEM 加10%胎牛血清终止消化并反复吹打致使神经元脱落。静置细胞悬液后计数，按106个/孔接种于多聚赖氨酸包被过夜的培养皿。待细胞贴壁后更换培养基为Neurobasal 复合培养液(2%B27 和1% GLU)。

1.2.2 细胞转染:由上海吉凯公司构建的带GFP标签shRNA 慢病毒用于敲低Cdkl5。慢病毒中以鼠源Cdkl5 为靶基因的目标序列是shRNA1(5'-GC AAAGATCTCACAAACAA-3')和shRNA2(5'-GCCGT TAACAGCTCAACAA-3')。按说明书于神经元体外培养活性较好的第7 天分别转染目的慢病毒和对照病毒，感染复数为9。

1.2.3 Real time PCR:Trizol 提取培养神经元RNA，按反转录剂盒说明合成高质量的cDNA，并进行SYBR Green real-time PCR。结果以2－△△CT方法分析。所有引物序列如表1。

1.2.4 Western blot 蛋白质印迹:10% 或者12%SDS-PAGE 分离蛋白，电泳后转膜2 h，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入TBST 稀释的1∶500 一抗Cdkl5多克隆抗体、1∶1 000 的Mecp2 单克隆抗体、1∶500的cleaved caspase-3 多克隆抗体、1∶5 000 的二抗小鼠抗兔IgG 或1 ∶5 000 的兔抗小鼠IgG 室温孵育1 h。ECL 显色液显色，胶片曝光后通过Image J 分析目的条带吸光度值。

1.2.5 CCK8 法:利用WST-8 法进行细胞活性检测。按试剂盒说明书测定450nm 吸光度值A 值(absorbance value，A value)。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 验证Cdkl5 敲低效率

体外培养的神经元分别转染shRNA1、shRNA2和对照病毒。随着感染时间增加，Cdkl5 的敲低效率逐渐增加。转染6 d 后神经元出现明显的空泡，状态较差，据此，选取转染后5 d(即DIV12)作为实验研究时间点。在mRNA 水平，shRNA1 和shRNA2敲低Cdkl5 的效率分别是65%和73% (图1A);在蛋白水平，shRNA1 和shRNA2 敲低Cdkl5 的效率分别是35%和75% (图1B，C)。因此，选择shRNA2作为敲低Cdkl5 的有效shRNA。

2.2 神经元内Cdkl5 敲低后Mecp2 的变化

培养神经元通过有效shRNA 敲低Cdkl5 以后，Mecp2 在mRNA 和蛋白水平的表达上调(P＜0.05)(图2，表2)。

2.3 Cdkl5 敲低后对Mecp2 及其本身下游靶基因的影响

相对于对照组，干扰组Psd95 升高，Bdnf 总转录体(Bdnf transcript Ⅺ)下降(P＜0.05)(图3)。

2.4 Cdkl5 敲低对神经元活性的影响

Cdkl5 敲低后细胞活性及凋亡状态没有明显的变化(表3)。

表1 Real time PCR 引物Table 1 Primer sequences for real time PCR

图1 原代皮质神经元Cdkl5 敲低效率Fig 1 The efficiency of silenced Cdkl5 in primary cortical neurons

图2 Cdkl5 敲低后Mecp2 的变化Fig 2 The effect of silenced Cdkl5 on the amounts of Mecp2

表2 Cdkl5 敲低神经元中Mecp2 在mRNA 和蛋白水平的相对表达量Table 2 Relative expression of Mecp2 on the level of mRNA and protein in Cdkl5-silenced neurons(±s，n=5)

表2 Cdkl5 敲低神经元中Mecp2 在mRNA 和蛋白水平的相对表达量Table 2 Relative expression of Mecp2 on the level of mRNA and protein in Cdkl5-silenced neurons(±s，n=5)

＊P＜0.05 compared with control shRNA group.

groupmRNAprotein control shRNA0.026 ±0.0040.305 ±0.270 Cdkl5 shRNA0.042 ±0.002*0.426 ±0.240*

图3 Cdkl5 敲低后Mecp2 相关下游基因的变化Fig 3 The effect of silenced Cdkl5 on the Mecp2-related target genes(±s)

表3 Cdkl5 敲低对神经元活力及凋亡状态的影响Table 3 The effect of silenced Cdkl5 on the cell viability and cell apoptosis(±s，n=4)

表3 Cdkl5 敲低对神经元活力及凋亡状态的影响Table 3 The effect of silenced Cdkl5 on the cell viability and cell apoptosis(±s，n=4)

groupsA valuecaspase3cleaved-caspase3 control shRNA3.500 ±0.250 0.117 ±0.0210.278±0.056 Cdkl5 shRNA3.300 ±0.170 0.159 ±0.0640.289 ±0.092

3 讨论

CDKL5 位于染色体Xp22，包含21 个外显子。归属于脯氨酸亚家族，并和细胞周期依赖样激酶同源，因此也被称为丝氨酸/苏氨酸激酶9。其蛋白在人类和啮齿类动物中枢神经系统中高表达，以大脑皮质区和海马区为著。研究显示CDKL5 减少会影响神经元轴突、树突形态生长过程，最终导致突触间信息传递异常［10］。关于MeCP2 与CDKL5 如何相互作用的研究较少。早期研究认为CDKL5 对MeCP2 没有行使特定位点的磷酸化功能［11］。但是，在鼠模型中敲低Mecp2 或者使用甲基化转移酶抑制剂却可以诱导Cdkl5 高表达［12］。鉴于两基因突变引起互相重叠的临床表现，本研究就这两分子相互关系进行探讨，发现神经元Cdkl5 敲低后出现明显的Mecp2 升高，这证实两者在分子水平具有负性相关的关系，同时提示其下游可能存在共同通路。

本研究还显示Cdkl5 敲低以后能诱发Bdnf 总转录体mRNA 下降。由于具有转录抑制功能的Mecp2 可以通过活性依赖的磷酸化修饰调节Bdnf表达量［13］，因此推测Bdnf 总转录体mRNA 下降的现象可能是由于Cdkl5 敲低后出现的Mecp2 升高所致，这与Mecp2 和Bdnf 本身存在的负性调节关系相一致。Cdkl5 位于突触的PSD 区域，提示Cdkl5 对兴奋性突触的重要性［7］。本研究发现Cdkl5 敲低的神经元中出现Psd95 明显表达上调，这与报道的结果［7］相反，可能是由研究对象及观察时间点的不一致造成的。

以往动物实验显示了Cdkl5 缺乏的小鼠神经元表现不同程度的破坏性，如神经元轴突树突结构简化，神经元活性降低等［7-8，14］，提示敲低Cdkl5 模型中存在凋亡现象。经过细胞活性及凋亡基因的检测，本研究只发现了符合细胞凋亡趋势的轻微无显著变化。这可能与鼠模型的Cdkl5 基因敲除程度有关。

本研究建立了稳定的Cdkl5 敲低的神经元模型，并初步提示Cdkl5 可能是通过对Mecp2 的调控诱导了下游靶基因的变化。目前关于Cdkl5 是否是Mecp2 的特异性磷酸化酶这个问题存在争议，且有研究报道Cdkl5 可能是通过磷酸化其他蛋白介导突触形态变化［15］。另有研究报道Cdkl5 功能可能是通过棕榈化其他蛋白实现的［10］。Cdkl5 与Mecp2究竟是否存在特定的关系从而影响功能、Cdkl5 与Mecp2 究竟如何引起表型的重叠以及差异尚需进一步的深入研究。

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