ATF4重组慢病毒抑制C2C12细胞增殖并促凋亡

夏 飞，伍志盟，李美玲，邓 莉，胡 勤，郭风劲

(重庆医科大学基础医学院细胞生物学及遗传学教研室发育生物学与模式动物平台，重庆400016)

内质网是蛋白质折叠以及修饰、钙离子储存的场所，ATF4(activating transcriptional factor4)是蛋白激酶R 样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)下游的重要信号分子［1］。当内质网中聚集大量错误折叠蛋白时，PERK 会进一步被激活，通过磷酸化真核细胞起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α)抑制蛋白质合成［2］，同时通过活化ATF4 上调C/EBP 同源蛋白(C/EBP homologous protein，Chop)基因的表达［3-4］，进而活化细胞凋亡途径的发生，参与细胞的整合应激反应过程，参与各种代谢异常、组织损伤等病理过程的发生、发展和转变［5］。

本实验成功构建和包装了人ATF4 基因重组慢病毒颗粒，并观察BMP2 诱导C2C12 成骨分化过程中，ATF4 基因慢病毒修饰对C2C12 细胞增殖和凋亡的影响，为进一步研究人ATF4 基因的生物学功能奠定基础，也为研究C2C12 成骨分化的分子机制提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

慢病毒表达载体pWPT-GFP-V5、慢病毒包装原件载体pMD2G 和pSPAX2(第二军医大学何志颖教授惠赠);HEK-293T 细胞和C2C12 细胞系由本实验室保存;限制性内切酶BamHⅠ、MluⅠ、Taq 聚合酶和DNA Marker(大连宝生物公司);T4DNA 连接酶(Promega 公司);质粒小量提取试剂盒和DNA 胶回收纯化试剂盒(Omega 公司);DMEM 培养基及胎牛血清(Hyclone 公司);ATF4、CHOP 抗体(Santa Cruz公司);Cleaved-Caspase3 抗体(Abcam 公司);p-JNK抗体(Cell Signaling 公司);HRP 标记的抗兔和抗鼠IgG 二抗(北京中杉金桥生物);鼠抗β-actin 单克隆抗体(天津三箭生物技术有限公司);脂质体LipofectamineTM2000(Invitrogen 公司);SDS-PAGE 凝胶配置试剂盒和ECL 化学发光试剂盒(碧云天生物技术研究所)。

1.2 ATF4 慢病毒载体的构建

1.2.1 引物设计:根据GenBank 中人ATF4 的CDS区的基因序列，设计并合成ATF4 的扩增引物，上游引物:cgcggatccTTTCTACTTTGCCCGCCCACAG;下游引物:cgacgcgtACTTTCCCTACAAAATAATTTATTG(下划线分别为BamHⅠ、MluⅠ酶切位点)，以真核表达载体pcDNA3.1(－)-ATF4 为模板扩增ATF4基因，扩增片段大小为1 251 bp。

1.2.2 ATF4 重组慢病毒载体质粒的构建:用限制性内切酶BamHⅠ、MluⅠ双酶切慢病毒载体pWPTGFP-V5，再与ATF4 目的基因通过T4 连接酶连接，构建载体pWPT-GFP-ATF4。连接产物转化DH5α感受态菌，37 ℃摇床过夜，质粒小量提取试剂盒提取质粒DNA 并酶切鉴定和测序鉴定。

1.3 慢病毒重组体的包装和靶细胞感染

转染前1 d 在2 个6 cm 的培养皿中接种对数增殖期的293T 细胞，次日将慢病毒载体pWPTGFP-V5 和重组慢病毒载体pWPT-GFP-ATF4 分别与辅助包装质粒pMD2G、pSPAX2 混合，按照LipofectamineTM2000 脂质体说明书分别将3 种质粒充分混合分别转染入293T 细胞中，3 种质粒各自加入12.5、7 和3.5 μg［6-7］。6 h 后换新鲜的细胞培养液，48、72 h 分别收集培养上清，0.45 μm 滤器过滤后－80 ℃保存［8-9］。

1.4 病毒滴度的检测

感染前1 d 在24 孔板中接种293T 细胞，按照孔稀释法倍比稀释浓缩的病毒上清，取100 μL 加入细胞中，孵箱过夜，第2 天更换DMEM 完全培养液，48 h 后荧光显微镜下观察绿色荧光数。1 个发绿色荧光的细胞为1 个表达单位(expression forming units，efu)，根据下面公式计算病毒滴度(efu/mL)和感染复数(MOI)［10］:病毒滴度=发绿色荧光的细胞数×病毒稀释倍数/0.1，MOI =病毒滴度×加入病毒体积/感染的细胞数。

1.5 FCM 检测ATF4 重组慢病毒对C2C12 细胞周期和凋亡的影响

1.5.1 细胞周期的检测:取对数期增殖的C2C12细胞接种于4 cm×6 cm 细胞盘，待细胞汇合至70%时加入4 μg/mL 的BMP2 蛋白，过24 h 后分别加入慢病毒LV-ATF4 和慢病毒LV-GFP，并设立空白对照NC 组和单BMP2 蛋白处理组。每个实验设置2个复孔，重复3 次(以下方法皆按此处理细胞)。再过48 h 后收集各组细胞用1 mL 的70%乙醇固定24 h，加入等体积的染料PI，4 ℃放置20～30 min后尼龙膜过滤，FCM 测定各组细胞周期情况。该检测由重庆医科大学生命科学院流式细胞监测中心完成。

1.5.2 细胞凋亡的检测:收集各组细胞用PBS 洗涤3 次，加入等体积PBS，应用FCM Annixin PE 法检测细胞凋亡。该检测由重庆医科大学生命科学院流式细胞监测中心完成。

1.6 蛋白质免疫印迹检测

各组细胞分别经预冷的PBS 冲洗3 次后，加入200 μL 的蛋白裂解液，用细胞刮缓缓刮下收集至1.5 mL 的离心管中，放置冰上充分裂解40 min，4 ℃12 000 ×g 离心15 min。取上清至新的离心管中，加入4 ×SDS 上样缓冲液，分装后至－80 ℃保存。3 种蛋白各取20 μL 于10% SDS-PAGE 电泳后，电转移至PVDF 膜上1 h，5%的脱脂奶粉封闭1 h;分别加入β-actin 鼠抗抗体和目的抗体，4 ℃过夜。次日吸取抗体液，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，ECL 显影。

1.7 透射电镜

收集上述各组细胞，加入戊二醛固定液后送往重庆医科大学生命科学院电镜室检测。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 慢病毒的滴度测定及最佳感染复数的确定

经倍比稀释法测定(图1A)得到慢病毒LVATF4 的滴度约为1 ×108efu/mL。LV-ATF4 慢病毒分别按感染复数(The multiplicity of infection，MOI)为20、40、60 的梯度感染C2C12 细胞，48 h 后荧光显微镜下观察荧光(图1B)，结果显示MOI =40 时，绿色荧光最强。蛋白质免疫印迹结果显示ATF4 慢病毒感染C2C12 细胞后ATF4 蛋白表达明显增多(图1C)。

2.2 FCM 检测ATF4 重组慢病毒对C2C12 细胞周期的影响

NC 组、BMP2 组和BMP2 +LV-GFP 组3 组之间细胞周期S 期差异不显著，而实验组BMP2 + LVATF4 细胞周期S 期与对照组BMP2 +LV-GFP 相比明显下降(P＜0.05)(图2)。

2.3 FCM 检测ATF4 重组慢病毒对C2C12 细胞凋亡的影响

BMP2 组和BMP2 +LV-GFP 组凋亡率高于NC组，实验组BMP2 +LV-ATF4 凋亡率为31.06%，显著高于对照组BMP2 + LV-GFP(11.86%)(P＜0.05)(图3)。

2.4 Western blot 检测凋亡相关蛋白的表达

BMP2 +LV-ATF4 实验组凋亡相关基因cleaved caspase-3、Chop 与p-JNK 的表达与BMP2 +LV-GFP对照组相比均明显增加(P＜0.05)(图4)。

2.5 透射电镜检测凋亡小体

在BMP2 持续诱导成骨细胞分化过程中，NC组、BMP2 组和BMP2 +LV-GFP 组细胞都未出现凋亡小体，而实验组BMP2 +LV-ATF4 细胞检测出现凋亡小体结构(图5)。

图2 FCM 监测在BMP2 处理条件下ATF4 重组慢病毒对C2C12 细胞周期的影响Fig 2 FCM analysis of cell cycle in C2C12 cells infected by LV-ATF4 with BMP2 treatment

图3 FCM 检测各组C2C12 细胞凋亡的结果Fig 3 FCM analysis of apoptosis rate in C2C12 cells

3 讨论

骨缺损是当前骨外科常见的问题之一。构建活性人工骨修复材料为骨缺损的修复提供了方向，有研究表明在BMP2 诱导下C2C12 细胞可以向成骨细胞分化［11］。BMP2 在促进骨形成过程中伴随着复杂的分子生物学调节机制，而ATF4 在其中的作用罕有报道。本研究发现，BMP2 诱导C2C12 成骨分化过程中，加入LV-ATF4 能抑制C2C12 细胞从G1期进入S 期，从而抑制细胞的增殖。在BMP2 诱导C2C12 成骨分化过程中，LV-ATF4 促进C2C12 细胞的凋亡，各凋亡相关基因cleaved casepase-3、Chop和p-JNK 的表达也明显上调。这是由于BMP2 在诱导软骨、成骨细胞分化时会引起内质网应激［12］，这时加入ATF4 重组慢病毒处理，会进一步激活凋亡相关基因cleaved casepase-3、Chop 和p-JNK 的表达，同时促进凋亡小体的形成，进而促进C2C12 细胞的凋亡，ATF4 这一生物学作用可能对BMP2 诱导C2C12 成骨细胞分化造成一定影响。

图4 蛋白质印迹监测内质网介导相关凋亡蛋白的表达Fig 4 Western blot analysis of expression of ER stress-mediated apoptosis related protein

图5 透射电镜检测各组C2C12 细胞的凋亡Fig 5 Analysis of apoptosis in different C2C12 cell groups detected by transmission electron microscope(scale bar=2 μm)

综上所述，本实验成功构建了LV-ATF4 慢病毒，研究ATF4 在成骨细胞分化过程中对细胞增殖及凋亡的作用。在体外实验中检测和发现在BMP2诱导C2C12 成骨细胞分化过程中，ATF4 能够通过减少S 期DNA 合成期细胞，抑制细胞的增殖，促进细胞的凋亡。本研究为进一步探讨ATF4 在成骨细胞分化中的生物学作用奠定基础，也为临床骨相关疾病的治疗提供一定的实验参考价值。

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