二甲双胍激活AMPK通路减轻饱和脂肪酸诱导的RAW264.7巨噬细胞炎性反应

杨 蕾，李 蓉，李 岱，敬媛媛，杨 利，陶安阳，周庆菊，赵红燕

(重庆医科大学附属第一医院内分泌科，重庆400016)

肥胖相关的慢性低度炎性反应是胰岛素抵抗发生的重要机制之一，在胰岛素抵抗相关代谢性疾病的发生发展中具有重要作用［1］。肥胖时体内饱和游离脂肪酸水平明显升高，升高的游离脂肪酸通过激活MAPK 和NF-κB 等炎性反应通路导致脂肪组织炎性反应的发生［2］，同时促进巨噬细胞聚集到白色脂肪组织，维持和加重这种慢性炎性反应［3］。越来越多的证据证明，脂肪组织中的免疫细胞，特别是巨噬细胞，在调控肥胖相关的慢性低度炎性反应中发挥着关键性的作用［4］。

激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)作为能量感受器在调节细胞和机体能量平衡中发挥着重要的作用。研究表明AMPK活化能够抑制脂肪酸、胆固醇的合成，增加脂肪酸的氧化、葡萄糖的转运、线粒体的生物合成［5］，最近的研究报道激活AMPK 还可能产生抗炎，抗肿瘤等作用［6］。而二甲双胍作为AMPK 的激动剂是否具有抗炎作用尚未有明确的报道。

因此，本研究拟以饱和脂肪酸刺激RAW264.7巨噬细胞，在体外建立一个代谢相关的炎性反应模型，初步探讨二甲双胍对巨噬细胞炎性反应的影响及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

RAW264.7 巨噬细胞系(ATCC 公司);饱和脂肪酸及二甲双胍(Sigma 公司);Compound C(Calbiochem 公司);CCK-8 试剂盒(上海七海复泰生物科技有限公司);实时定量PCR 反转录及扩增试剂盒(TaKaRa 公司);ELISA 试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);小鼠AMPK 抗体及磷酸化AMPK(Thr 172)抗体(Cell Signaling 公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及实验分组:RAW264.7 巨噬细胞用高糖DMEM 培养基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 mg/L 链霉素)于37 ℃、5% CO2的细

胞孵箱中培养。根据不同的干预药物，将实验分为4 组:正常对照组、饱和脂肪酸干预组、二甲双胍+饱和脂肪酸干预组、10 μmol/L Compound C +二甲双胍+饱和脂肪酸干预组。本实验中饱和脂肪酸的干预浓度均为250 μmol/L，AMPK 抑制剂Compound C 于二甲双胍及饱和脂肪酸干预前30 min 加入，24 h后收集细胞提取细胞RNA，收集细胞上清用于ELISA 检测。所有实验均独立重复3 次。

1.2.2 CCK-8 法检测二甲双胍联合饱和脂肪酸对RAW264.7 巨噬细胞增殖与毒性的影响:取对数期细胞，调整为5 ×104个/mL，每孔100 μL 接种于96孔板，分别以1 或2 mmol/L 二甲双胍联合饱和脂肪酸处理，每组设3 个副孔，具体操作步骤按照说明书进行。根据公式计算细胞存活率，细胞存活率(%)=［A(加药)－A(空白)］/［A(正常细胞)－A(空白)］×100%。

1.2.3 实时定量PCR 检测TNF-α 和IL-6 mRNA表达水平:采用Trizol 法提取出总RNA 后，反转录为cDNA，进行实时定量PCR 反应，具体操作步骤按照说明书进行，引物设计见表1。根据实时荧光定量扩增曲线测得目的基因及内参基因的Ct 值，目的基因的表达水平用β-actin 进行标准化，通过2－△△ct法分析。

表1 相关基因引物序列Table 1 Related gene primer sequences

1.2.4 ELISA 法检测细胞上清中TNF-α 和IL-6 的分泌水平:收集干预好的细胞上清液于－20 ℃保存备用，按照试剂盒说明书进行操作，最后根据测定的吸光度值，绘制标准曲线，计算待测因子浓度。

1.2.5 Western blot 法检测AMPK 及p-AMPK 的表达:药物干预RAW264.7 巨噬细胞60 min 后，提取细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，计算上样量。配制12%的分离胶和4%的浓缩胶，每孔加入30 μg蛋白样品进行SDS-PAGE 电泳分离后，转膜90 min，5% BSA 封闭2 h，一抗(1∶5 000)4 ℃孵育过夜，二抗(1∶2 000)37 ℃孵育2 h，TBST 洗膜，ECL 试剂显影及成像，AMPK 蛋白及p-AMPK(Thr 172)蛋白的表达结果以β-actin 作为内参照物，以吸光度比值表示。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 二甲双胍联合饱和脂肪酸对RAW264.7 巨噬细胞增殖与毒性的影响

2 mmol/L 的二甲双胍联合饱和脂肪酸处理RAW264.7 巨噬细胞24 h 后，细胞的存活率均在95%以上(图1)。因此，本研究选择2 mmol/L 二甲双胍作为后续实验的药物干预浓度。

图1 不同浓度二甲双胍联合饱和脂肪酸对RAW2674.7 巨噬细胞存活率的影响Fig 1 Influence of different concentrations of metformin on RAW264.7 macrophage viability(±s，n=3)

2.2 二甲双胍对饱和脂肪酸诱导的RAW264.7 巨噬细胞炎性因子mRNA 表达的影响

与对照组比较，饱和脂肪酸刺激RAW264.7 细胞24 h 后，TNF-α 及IL-6 的mRNA 表达水平均显著升高(P＜0.05);与饱和脂肪酸组比较，二甲双胍+饱和脂肪酸干预组TNF-α 及IL-6 的mRNA 表达水平均降低(P＜0.05);而加入AMPK 的抑制剂Compound C 后，二甲双胍降低TNF-α 及IL-6 mRNA 表达的作用明显减弱(P＜0.05)(图2)。

图2 二甲双胍对饱和脂肪酸诱导的巨噬细胞炎性因子TNF-α 及IL-6 mRNA 表达的影响Fig 2 The impact of metformin on saturated fatty acidinduced macrophage inflammatory cytokines TNF-α and IL-6 mRNA expression(±s，n=3)

2.3 二甲双胍对饱和脂肪酸诱导的RAW264.7 巨噬细胞炎性因子分泌水平的影响

与对照组比较，饱和脂肪酸干预组细胞上清中TNF-α 和IL-6 的分泌量均升高(P＜0.05);与饱和脂肪酸组比较，加入二甲双胍后TNF-α 和IL-6 的分泌水平均下降(P＜0.05);加入AMPK 的抑制剂Compound C 后，二甲双胍降低饱和脂肪酸诱导的TNF-α及IL-6 分泌作用明显减弱(P＜0.05)(图3)。

2.4 二甲双胍对RAW264.7 巨噬细胞AMPK 磷酸化水平的影响

与对照组比较，饱和脂肪酸干预细胞60 min 后AMPK 的磷酸化水平明显减弱(P＜0.05);与正常组及饱和脂肪酸组比较，二甲双胍+饱和脂肪酸干预细胞60 min 后AMPK 的磷酸化水平增强(P＜0.05)，加入Compound C 后，AMPK 的磷酸化水平降低(P＜0.05)(图4)。

图3 二甲双胍对饱和脂肪酸诱导的巨噬细胞炎性因子TNF-α 及IL-6 蛋白分泌水平的影响Fig 3 The impact of metformin on saturated fatty acidinduced macrophage inflammatory cytokines TNF-α and IL-6 protein level(±s，n=3)

3 讨论

高脂饮食及静坐的生活方式使肥胖的发病率逐年增加，肥胖相关的2 型糖尿病、心血管疾病给社会带来了沉重的负担。长期高脂饮食导致体内游离饱和脂肪酸升高，刺激以巨噬细胞为主的免疫细胞，激活多条炎性反应通路促使炎性因子TNF-α 和IL-6等的分泌［3］。长期高水平炎性因子诱导胰岛素靶细胞产生胰岛素抵抗，促使慢性炎性反应的发生发展［7］。本研究采用游离饱和脂肪酸刺激巨噬细胞，在体外建立代谢相关的炎性反应模型证实饱和脂肪酸刺激巨噬细胞后，炎性因子TNF-α 及IL-6 的分泌水平显著升高。

图4 二甲双胍及饱和脂肪酸对巨噬细胞AMPK磷酸化水平的影响Fig 4 Effects of metformin and saturated fatty acids on macrophage AMPK phosphorylation level(±s，n=3)

近来，二甲双胍的抗炎作用受到广泛的关注。一些研究观察到二甲双胍对患者体内炎性标志物具有益影响，2 型糖尿病患者在二甲双胍治疗3 个月后，血清TNF-α 水平较治疗前明显降低，且这种效应与二甲双胍的降糖作用无关［8-9］。另一些研究则认为，二甲双胍对患者体内的炎性标志物没有影响。在这些研究中，糖耐量受损患者或2 型糖尿病患者接受二甲双胍治疗16 周，患者血清中TNF-α 及CRP 的水平并没有发生变化［10-11］。因此，二甲双胍有无明确的抗炎效应有待进一步研究。本研究结果显示，二甲双胍能够抑制饱和脂肪酸诱导的巨噬炎性因子TNF-α 及IL-6 的产生，这与采用细菌脂多糖建立体外急性炎性反应模型观察二甲双胍抗炎作用的结果一致［12］。

本研究进一步发现二甲双胍增强巨噬细胞AMPK 的磷酸化水平，AMPK 的抑制剂Compound C使二甲双胍增强AMPK 磷酸化的作用及抑制饱和脂肪酸诱导炎性因子分泌的作用减弱。这些结果提示，二甲双胍通过活化AMPK 产生抗炎效应。二甲双胍以一种AMPK 依赖的方式激活转录因子-3 进而减轻脂多糖诱导的巨噬细胞急性炎性反应［12］。近来有研究报道激活AMPK 能够改变巨噬细胞的极化状态，促使巨噬细胞活化为抗炎的细胞亚型［13］，这可能是二甲双胍激活AMPK 产生抗炎作用的另一个机制。

综上所述，本研究发现二甲双胍活化AMPK 改善饱和脂肪酸诱导的巨噬细胞炎性反应。这提示二甲双胍可能具有改善慢性炎性反应的作用，为临床使用二甲双胍治疗肥胖相关的代谢性疾病提供了一些线索，但具体作用机制需要进一步研究。

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