不同乙型肝炎病毒DNA载量患者磷脂酰肌醇-4-磷酸酶的表达差异及其意义

欧阳蓉,曾正莲

(天门市第一人民医院检验科，湖北 天门 431700)

不同乙型肝炎病毒DNA载量患者磷脂酰肌醇-4-磷酸酶的表达差异及其意义

欧阳蓉,曾正莲※

(天门市第一人民医院检验科，湖北 天门 431700)

摘要：目的探究不同乙型肝炎病毒(HBV) DNA载量患者磷脂酰肌醇-4-磷酸酶(PI4Kα)的表达差异及其意义。方法收集2013年1月至2015年1月在天门市第一人民医院接受治疗的150例慢性乙型肝炎患者及50例同时期体检健康人群的血清，利用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测所有研究对象血清的HBV DNA载量，并根据患者血清HBV DNA载量分为高病毒载量组(HBV DNA>1×105拷贝/L)、中病毒载量组(HBV DNA 1×102~1×105拷贝/L)及低病毒载量组(HBV DNA<1×102拷贝/L)3组，各50例。另外选择50例健康体检者的血清作为对照组。比较4组血清HBV DNA载量，采用酶联免疫吸附测定(ELISA)双抗体夹心法对4组外周血清的PI4Kα水平进行检测，分析HBV DNA载量与PI4Kα表达的相关性。结果高、中、低病毒载量组及对照组HBV DNA载量和血清PI4Kα水平分别为(5.6±1.3)拷贝/L、(3.5±0.6)拷贝/L、(1.7±0.5)拷贝/L、(1.1±0.3)拷贝/L和(4.3±0.8) μg/L、(3.4±0.7) μg/L、(2.8±0.7) μg/L、(2.2±0.6) μg/L，各组比较差异有统计学意义(P<0.01)，其中高、中及低病毒载量组HBV DNA载量和血清PI4Kα水平显著高于对照组(P<0.05)，高、中病毒载量组显著高于低病毒载量组(P<0.05)，高病毒载量组显著高于中病毒载量组(P<0.05)。随着血清HBV DNA载量的增加，PI4Kα水平也显著升高，两者呈正相关(rspan=0.732，P<0.05)。结论慢性乙型肝炎患者血清PI4Kα的水平随着HBV DNA载量的增加而增加，两者密切相关，提示PI4Kα对HBV DNA的复制有重要作用。

关键词：慢性乙型肝炎；乙型肝炎病毒 DNA载量；磷脂酰肌醇4-磷酸酶

慢性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)引起的，主要以肝脏炎症病变为主，并可引起多器官损害的一种疾病，主要侵犯儿童和青少年，少数患者可进展为肝硬化或肝癌[1]。目前，慢性乙型肝炎广泛流行于世界各国，已成为严重威胁人类生命健康的世界性疾病，也是我国流行最为广泛、严重的疾病[2]。近年来，随着社会环境质量的下降，乙型肝炎的发病率有明显上升的趋势[3]。HBV是一种DNA病毒，只对人和猩猩具有易患性，HBV侵入人体后，需在肝细胞内进行复制，其复制水平与生物活性在一定程度上可由血清HBV DNA载量来反映[4]。HBV在体内的复制会受到宿主体内各种因素的影响，干扰影响HBV复制的宿主因素能有效抑制HBV的复制，从而有效控制乙型肝炎的发展。研究显示，磷脂酰肌醇-4-磷酸酶(phosphatidylinositol 4-kinase Ⅲ alpha，PI4Kα)参与了丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)的复制，PI4Kα的抑制剂可以明显抑制HCV的复制[5-6]。本研究通过荧光定量聚合酶链反应(fluorescent quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)检测血清HBV DNA载量及采用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)双抗体夹心法测定血清PI4Kα的水平，分析两者间的相关性，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料选择2013年1月至2015年1月在天门市第一人民医院接受治疗的150例乙型肝炎患者作为研究对象。参考2010年中华医学会修订的《慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准[7]，所有患者均为乙型肝炎患者，且均为首发病例。根据患者血清HBV DNA 载量将其平均分为高病毒载量组(HBV DNA>1×105拷贝/L)、中病毒载量组(HBV DNA 1×102~1×105拷贝/L)及低病毒载量组(HBV DNA<1×102拷贝/L)3组，各50例。高病毒载量组中男27例、女23例，年龄20～26岁，平均(23.0±1.0)岁；中病毒载量组中男26例、女24例，年龄20～26岁，平均(24.0±0.7)岁；低病毒载量组中男29例、女21例，年龄21～26岁，平均(23.0±1.0)岁。另外选择50例健康体检者的血清作为对照组，其中男28例、女22例，年龄20～26岁，平均(23.0±0.9)岁。4组受试者在性别、年龄等一般临床资料方面比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会审查批准，患者知情同意并签署知情同意书。

1.2研究方法收集不同病毒载量组及对照组清晨空腹静脉血6 mL，离心半径6 cm， 3000 r/min，离心15 min，取上层血清并分装于Eppendorf(EP)管内，-90 ℃条件下冷冻保存。采用FQ-PCR测定以上血清HBV DNA载量，同时采用ELISA法测定所有受试者血清中PI4Kα的水平。

2结果

2.1各组受试者HBV DNA载量经对数转换后比较高、中、低病毒载量组及对照组血清HBV DNA载量比较差异有统计学意义(P<0.01)，组间两两比较结果显示，高、中及低病毒载量组HBV DNA载量显著高于对照组(P<0.05)，高及中病毒载量组HBV DNA载量显著高于低病毒载量组(P<0.05)，高病毒载量组HBV DNA载量显著高于中病毒载量组(P<0.05)。见表1。

表1　各组受试者HBV DNA载量经对数转换后比较　，拷贝/L)

HBV:乙型肝炎病毒；a与对照组比较，P<0.05；b与高病毒载量组比较，P<0.05；c与中病毒载量组比较，P<0.05

2.2各组受试者血清PI4Kα水平的比较高、中、低病毒载量组及对照组血清PI4Kα水平比较差异有统计学意义(P<0.05)，组间两两比较结果显示，高、中及低病毒载量组血清PI4Kα水平高于对照组(P<0.05)，高病毒载量组血清PI4Kα水平高于中病毒载量组(P<0.05)。见表2。

表2各组受试者血清PI4Kα水平比较

组别例数PI4Kα对照组 502.2±0.6低病毒载量组502.8±0.7abc中病毒载量组503.4±0.7ab高病毒载量组504.3±0.8aF86.260P0.000

PI4Kα：磷脂酰肌醇-4-磷酸酶；a与对照组比较，P<0.05；b与高病毒载量组比较，P<0.05；c与中病毒载量组比较，P<0.05

2.3血清PI4Kα水平与HBV DNA载量的相关性分析Spearman分析结果显示，随着血清HBV DNA载量的增加，血清PI4Kα水平显著升高，两者呈正相关(rs=0.732，P<0.05)。

3讨论

慢性乙型肝炎是我国常见的慢性传染病之一，由HBV感染侵袭肝细胞引起，HBV侵染宿主后，使机体免疫功能低下，易被各种细菌、病毒感染，加重机体原有的疾病状态，主要表现为乏力、恶心、厌食、腹胀及肝区疼痛等症状，有较高的传染率，据估计，全球每3人中就会有1人感染HBV，而其中有2.4亿～3.5亿人会转变成慢性乙型肝炎[8]。虽然大部分慢性肝炎患者无明显症状，但仍约有25%长期感染的患者进展成为肝纤维化、肝硬化及肝癌[9]。在我国，母婴传播是HBV主要的传播方式，这也是造成乙型肝炎在我国呈家族聚集特征的主要原因。近年来，有调查显示，乙型肝炎患者发病率有明显上升趋势，估计每年因乙型肝炎死亡的人数约为75万人[10]。乙型肝炎患者常并发糖尿病、脂肪肝及肝炎后高胆红素血症等严重影响人们正常生活的疾病，其高致死率亦严重危害人民的生命与健康。目前，已有大量有关乙型肝炎治疗方法的研究，并取得相应的进展，但乙型肝炎仍然是一个全球性的健康问题[11]，HBV DNA的持续复制是促进肝炎转化为肝硬化与肝癌的主要原因，而由于受其自身基因组大小的限制，其在宿主体内的复制需结合在宿主基因组上，因而其复制的过程受到机体多种因素的调节，寻找并抑制促进HBV DNA复制的因子，从而最大限度地抑制其复制、清除病毒，进而稳定患者病情是目前治疗乙型肝炎的主要研究思路与方向[12]。而PI4Kα就是调节HBV DNA复制的宿主主要因子之一。

2009年国外相关实验室通过全基因组范围的小干扰RNA文库筛选的方法证实，PI4Kα是参与HCV复制的一种宿主因子，是HCV复制所必需的[13]。PI4Kα是由PI4KCα基因编码的一种脂激酶，是人体内4种磷脂酰肌醇-4-激酶之一，属于磷脂酰肌醇的家族成员之一。其主要生物学作用为催化多聚磷脂酰肌醇的合成，调控细胞内的信号转导、内质网上囊泡的运输及脂质代谢，PI4Kα主要位于内质网，极少量存在于血浆膜，其在高尔基体功能中也发挥着特定的作用。国外研究发现，在HCV感染细胞内的复制过程中，PI4Kα发挥着重要作用，是该过程不可缺少的宿主蛋白之一，其主要机制如下：HCV在宿主体内主要通过调整肝细胞内膜，促使其产生特定的微环境，建立特殊的复制平台保证自身有效的复制，HCV主要以内质网膜作为复制膜的来源，此过程主要由HCV非结构蛋白5A(non-structural protein 5A,NSSA)诱导产生，宿主体内PI4Kα因子是复制膜组成所必须的，HCV NSSA可以激活并募集PI4Kα到达内质网膜，使内质网内的PI4Kα水平增加，PI4Kα可以改变内质网膜的曲率，产生高曲率的膜袋，从而保护HCV蛋白及其RNA免受宿主的攻击破坏，同时PI4Kα的401～600位氨基酸与NSSA的结构域Ⅰ发生相互作用，使病毒复制蛋白在细胞内精准定位，并维持内质网膜的稳定性和完整性，最终促进HCV的复制[14]。采用PI4Kα抑制剂后，HCV DNA的复制明显受到抑制。相关研究发现，PI4Kα抑制剂可以抑制PI4Kα与HCV NSSA的结合，从而抑制HCV的复制，因此PI4Kα通过与NSSA结合并促使其磷酸化，从而促进HCV的复制，PI4Kα的活性对HCV的复制起着至关重要的作用。相关学者采用敲除野生型细胞中PI4Kα基因的方法进行营救窒息突变细胞的研究证实了此观点，研究发现，慢性丙型肝炎患者HCV感染组织细胞中均检测到PI4Kα的催化产物磷脂酰肌醇-4-磷酸明显升高[15]。目前，国内外有关PI4Kα与病毒性肝炎的研究主要侧重于丙型肝炎，而PI4Kα与HBV在感染肝细胞内的复制是否有密切关系尚缺乏大量研究证实。

有学者研究显示，乙型肝炎的传播概率与受HBV感染者体内的HBV DNA载量呈正相关，且慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA载量与其肝纤维化程度及肝组织炎症分级亦呈正相关[16]。因此，研究如何控制HBV的复制对改进乙型肝炎的治疗方法和思路有重要意义。研究显示，干扰PI4Kα的表达后，HBV的复制效率显著降低[14]，说明PI4Kα同样参与HBV DNA在宿主体内的复制过程。本研究结果显示，与对照组相比，高、中及低病毒载量组患者HBV DNA载量、PI4Kα水平明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)；Spearman分析结果显示，慢性乙型肝炎患者血清PI4Kα水平与血清HBV DNA载量呈正相关(P<0.05)，表明PI4Kα的表达与患者血清HBV DNA载量密切相关，PI4Kα因子可能参与了HBV DNA的复制，在一定程度上可提示HBV DNA在宿主体内的复制速率。本研究结果与Mirabelli等[17]的研究结论一致。

综上所述，PI4Kα有望成为新的治疗乙型肝炎的靶标，为控制HBV感染及治疗乙型肝炎提供了全新的思路及方法。而PI4Kα参与HBV DNA复制的具体机制尚未完全阐明，有待进一步研究，即遏制HBV传播及治疗乙型肝炎的方法有待进一步明确及改进。

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The Difference of the Expression of Phosphatidylinositol 4-kinase Ⅲ alpha in Patients with Different HBV DNA Load and Its SignificanceOUYANG-Rong,ZENGZheng-lian.(DepartmentofClinicalLaboratory,TianmenCityFirstHospital,Tianmen431700,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the difference of the expression of phosphatidylinositol 4-kinase Ⅲ alpha (P14Kα)in serum between patients with different hepatitis B virus(HBV) DNA loads and its significance.MethodsSerum samples were collected from 150 patients with chronic hepatitis B(CHB) and 50 healthy people in Tianmen City First Hospital during Jan.2013 and Jan.2015,whose HBV DNA loads were determined by fluorescent quantitative polymerase chain reaction(FQ-PCR).According to the serum HBV DNA loads,the 150 patients were divided into three groups:high viral load group(HBV DNA load>1×105copies/L),medium viral load group(1×105copies/L≤HBV DNA≤1×102copies/L),and low viral load group(HBV DNA load<1×102copies/L),while the serum samples of 50 healthy people were selected as control group.The HBV DNA loads in serum between the four groups were compared.Enzyme-linked immunosorbent assay was used to determine the concentration of PI4Kα in peripheral serum,Spearman inspection was used to analyze the correlation between HBV DNA loads and the expression level of PI4Kα.ResultsHBV DNA load and serum PI4Kα level of high,medium and low viral load group and control group were (5.6±1.3) copies/L,(3.5±0.6) copies/L,(1.7±0.5) copies/L，(1.1±0.3) copies/L and (4.3±0.8) μg/L,(3.4±0.7) μg/L,(2.8±0.7) μg/L,(2.2±0.6) μg/L,there were significant differences between the four groups(P<0.05).Among them,HBV DNA load and serum PI4Kα level of the high and low viral load were significantly higher than that of the control group (P<0.05),and the high and medium viral load group was significantly higher than that of the low viral load group (P<0.05),high viral load group was significantly higher than that of the low viral load group (P<0.05).The HBV DNA load and PI4Kαconcentration presented a positive correlation with each other,i.e.serum PI4Kα level would be elevated with the increase in HBV DNA load(rs=0.732,P<0.05).ConclusionSerum PI4Kα level is elevated with the increase in HBV DNA load,the concentration of serum PI4Kα is closely correlated with the HBV DNA load in patients with CHB,which suggests that PI4Kα may play a crucial role in the HBV DNA replication.

Key words：Chronic hepatitis B; Hepatitis B virus DNA load; Phosphatidylinositol 4-kinase Ⅲ alpha

收稿日期：2015-04-19修回日期：2015-06-16编辑：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.17.050

中图分类号：R575.1

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)17-3207-03