来氟米特对实验性变态反应性脑脊髓炎小鼠Th1/Th2平衡的影响

袁正洲，李作孝※，李经伦，杨　波，林　洋，黎　兰

(1.泸州医学院附属医院 a.神经内科，b.介入科，四川 泸州 646000； 2.泸州医学院护理学院，四川 泸州 646000)

论著

来氟米特对实验性变态反应性脑脊髓炎小鼠Th1/Th2平衡的影响

袁正洲1a，李作孝1a※，李经伦1a，杨波1b，林洋1b，黎兰2△

(1.泸州医学院附属医院 a.神经内科，b.介入科，四川 泸州 646000； 2.泸州医学院护理学院，四川 泸州 646000)

摘要：目的探讨来氟米特(LEF)对实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)的防治作用及其可能的免疫学机制。方法将36只雌性C57BL/6小鼠依据随机数字表法分为大、小剂量LEF防治组及EAE对照组，每组12只。采用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55构建EAE模型。从造模前3 d开始起EAE对照组及大、小剂量LEF防治组分别予以生理盐水、LEF 8 mg/(kg·d)、2 mg/(kg·d)灌胃，连续10 d。观察小鼠发病情况及外周血中白细胞介素4(IL-4)、γ干扰素(IFN-γ)水平及其比值变化。结果与EAE对照组相比，LEF各防治组小鼠临床症状较轻，且外周血中IL-4、IL-4/INF-γ值增高(P<0.01)，INF-γ水平显著降低(P<0.01)，且与小剂量相比大剂量降低更明显。结论LEF对EAE具有防治作用，且效果呈剂量依赖性。其防治作用可能与调节Th1/Th2比例平衡，Th0分化向Th1漂移有关。

关键词：实验性变态反应性脑脊髓炎；多发性硬化；来氟米特；Th1/Th2平衡

多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种以中枢神经系统不同部位及不同程度白质脱髓鞘为主要病理特征的自身免疫性疾病[1]。该病好发于青壮年女性，全球约250万患者。来氟米特(leflunomide,LEF)是人工合成的嗯唑类化合物，作为一种新型的免疫抑制剂最早应用于器官移植[2]。LEF在自身免疫性疾病中也取得了较好的疗效，且药物不良反应较小[3]。目前国内还未见报道其用于防治MS或实验性变态反应性脑脊髓炎(experimental allergic encephalitis,EAE)的研究，本研究探讨LEF对EAE是否具有防治作用及其对Th1、Th2型细胞因子的影响。

1材料与方法

1.1实验动物雌性C57BL/6小鼠36只，6～8周龄，体质量为18～22 g，合格证号：201303523，2013年3月购自四川大学华西实验动物中心，为一级合格动物。实验前在泸州医学院附属医院中心实验室常规饲养7 d。

1.2实验药品及试剂LEF片购自苏州长征-欣凯制药有限公司(批号:X20012550)。髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55多肽(MOG35-55)由上海强耀生物科技有限公司合成，纯度>95%；结核分枝杆菌H37RaMT购自美国BD公司(批号:25177-549)；百日咳毒素(PTx)购自瑞士Alexis公司(批号:12687-177)；福氏不完全佐剂(incomplete Freundls adjuvant,IFA)购自美国Sigma公司。白细胞介素4(interleukin 4,IL-4)检测试剂盒购自北京华英生物技术研究所产品(批号：20120625)；干扰素γ (interferon γ,INF-γ) 酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒购自晶美生物工程有限公司(批号：20121076)。

1.3方法

1.3.1EAE模型制作将36只小鼠依据随机数字表法分为3组：EAE对照组及大、小剂量LEF防治组，每组12只。将MOG35-55及结核分枝杆菌H37RaMT溶解于IFA中制成免疫抗原，其中每毫升抗原含1 mg MOG35-55及4 mg结核分枝杆菌。在小鼠后背中线两侧分四点注入免疫抗原，每只注入0.2 mL。在造模后当天及第2日，每只小鼠腹腔注射PTx 200 ng 加强免疫反应。

1.3.2模型干预从造模前3 d起每日大、小剂量LEF组分别予以LEF片8 mg/(kg·d)、2 mg/(kg·d) (用2 mL注射用生理盐水溶解)灌胃；EAE对照组每日2 mL生理盐水灌胃，连续10 d。

1.3.3动物模型评价每日定时对实验C57BL/6小鼠进行神经功能障碍评分。评分标准：0分，未发病；1分，后肢轻度无力(包括尾巴无力)；2分，中度后肢无力或者轻度共济失调；3分，中至重度后肢无力；4分，严重后肢无力；5分，中度以下四肢无力的截瘫；6分，四肢全瘫或严重共济失调或者死亡[4]。EAE C57BL/6小鼠在发病高峰期，即连续3 d症状评分无加重、四肢瘫痪或死亡时处死动物。

1.3.4IL-2、IL-4、INF-γ、TNF-α水平测定实验终止时取小鼠心脏动脉血2 mL，ELISA法检测IL-4及INF-γ水平，检测方法依试剂说明书，通过标准品吸光度值绘制标准曲线再计算各样本值。

2结果

2.1EAE对照组及LEF各防治组发病潜伏期、进展期及临床表现C57BL/6小鼠造模后主要表现为精神萎靡、活动减少、食欲减弱、体质量下降等。注射抗原17 d左右EAE小鼠逐渐出现单后肢或双后肢或伴前肢不同程度的无力、共济失调及瘫痪；潜伏期、进展期及神经功能障碍评分组间比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，且与EAE对照组相比，小、大剂量LEF组症状明显减轻，表现为潜伏期天数延长、进展期缩短、神经功能障碍评分降低(均P<0.05)。与小剂量LEF组比较，大剂量LEF防治组发病潜伏期延长、进展期缩短、神经功能障碍评分降低(均P<0.05)。见表1。

表1　EAE对照组及LEF各防治组发病潜伏期和

EAE：实验性变态反应性脑脊髓炎；LEF：来氟米特；a与EAE对照组比较，P<0.05；b与小剂量LEF防治组比较，P<0.05

2.2EAE对照组及LEF各防治组C57BL/6小鼠发病高峰期IL-4、INF-γ水平及其比值3组IL-4、INF-γ水平及其比值组间比较差异有统计学意义(均P<0.01)，且LEF各防治组Th2型细胞因子IL-4水平、IL-4/INF-γ值较EAE对照组明显增高，Th1型细胞因子 INF-γ水平较EAE对照组明显降低(均P<0.05)。与小剂量LEF防治组比较，大剂量LEF防治组C57BL/6小鼠发病高峰期IL-4水平增高、INF-γ水平降低，IL-4/INF-γ值增高(均P<0.05)。见表2。

表2EAE对照组及LEF各防治组发病高峰期

组别只数IL-4(ng/L)INF-γ(μg/L)IL-4/INF-γ(×1000)EAE对照组1211.66±1.2315.35±1.050.78±0.10小剂量LEF防治组1216.24±0.84a12.86±0.47a1.32±0.80a大剂量LEF防治组1220.24±0.56ab11.42±0.86ab1.80±0.13abF236.4350.15279.78P<0.01<0.01<0.01

EAE：实验性变态反应性脑脊髓炎；LEF：来氟米特；IL-4：白细胞介素4；INF-γ：干扰素γ；a与EAE对照组比较，P<0.05；b与小剂量LEF防治组比较，P<0.05

3讨论

LEF是美国食品药品管理局于1998年批准用于类风湿关节炎治疗的一种新型免疫抑制剂，最早应用于器官移植，LEF同时也已用于自身免疫性疾病的治疗。LEF通过抑制二氢乳酸脱氢酶及酪氨酸激酶以减少嘧啶的形成，致使DNA合成障碍，进而抑制淋巴细胞活化及由此而致的免疫反应[5]。

MS是中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病，是神经病学中自身免疫介导的典型疾病之一。MS可能是遗传易患个体与环境因素相互作用而发生的自身免疫所介导的疾病。MS的理想动物模型EAE造模动物发展种类繁多，猴、Wistar大鼠、SJL/J小鼠、C57BL/6小鼠均有报道[6-8]。C57BL/6小鼠是用来建立MS模型的理想品系，但由于其价格较高等原因，国内较少使用，而国际上普遍采用C57BL/6小鼠构建稳定的模型[6]。本实验选择8 mg/(kg·d)、2 mg/(kg·d)两种剂量LEF对EAE小鼠进行干预，结果显示，LEF通过发挥其抗炎功能，能延长EAE发病潜伏期、缩短进展期、降低神经功能障碍评分，对EAE有保护作用且呈剂量依赖关系。

MS患者具有多个异常的免疫环节，包括自身抗体破坏髓鞘以及自身反应性T细胞激活，同时MS患者脑脊液、外周血以及脑组织中出现多种活化反应性T细胞[9]。CD4+T细胞在遇到特定的抗原时分化成两类能够分泌不同细胞因子的细胞如Th1细胞、Th2细胞。Th1细胞与细胞免疫有关，Th2细胞通常与体液免疫有关[10]。IFN-γ、TNF-α是典型的与Th1细胞有关的细胞因子。这些细胞因子有促进炎症反应的功能：激活巨噬细胞、增强抗原递呈和诱导T细胞的反应，是致使EAE发病(复发)的重要因子[11]。典型的Th2细胞促进抗体产生，包括IL-4等，对EAE的病情恶化起抑制功能。研究显示，将促进IL-4表达的重组基因注入EAE大鼠脑脊液中，可使IL-4表达增加，减轻EAE的病情[12]。研究显示，在EAE急性期IL-4水平低于正常，无法抑制INF-γ促进中枢神经系统自身免疫反应及其脱髓鞘作用，但在恢复期中它可通过增强Th2细胞功能，抑制Th1细胞炎性细胞因子分泌及其活化，从而促使EAE的恢复[13]。敲除IL-4基因的小鼠，T细胞及其亚群发育虽正常，但不能诱导Th2型细胞因子产生，说明IL-4作为免疫调节因子能抑制EAE发生、发展，其作为Th2细胞因子可抑制Thl型细胞因子的相关作用及下调Thl细胞的活性[14]。研究发现，Thl类反应在MS与EAE体内反应程度增强，Th1类炎性细胞因子由于过度表达因而募集淋巴细胞进而激活巨噬细胞并刺激产生氧自由基、白三烯、蛋白溶解酶TNF-α等，并且抑制如IL-4等的抗炎性作用的细胞因子分泌，最终导致B细胞增殖活跃，产生自身抗体造成髓鞘的损伤而诱发MS[15]。免疫系统正常运转中，Th1与Th2细胞的平衡性是基础，其失衡导致疾病发生，EAE病情在Th1类细胞反应向Th2类细胞反应漂移时有缓解趋势。本研究结果显示，LEF防治组小鼠发病高峰期IL-4水平、IL-4/INF-γ值较EAE对照组增强，分泌INF-γ能力较EAE对照组减弱，说明LEF能使EAE小鼠外周血Th1/Th2恢复平衡，促使Th0分化向Th2漂移而发挥对EAE的保护作用。

总之，LEF能对EAE发挥防治作用：延长EAE发病潜伏

期、缩短进展期、降低神经功能障碍评分，且剂量依赖关系作用效果明显。其保护作用可能与促使Th0分化向Th2漂移，促使Th1/Th2恢复平衡有关。LEF为防治MS提供了新的研究方向，而LEF对Th1及Th2细胞水平产生影响的具体机制有待于进一步研究。

参考文献

[1]Pimentel ML.Natalizumab and multiple sclerosis[J].Arq Neuropsiquiatr,2013,71(3):135-136.

[2]Jahan A,Dewan V,Yadav TP.Leflunomide in systemic onset Juvenile idiopathic arthritis[J].Indian pediatrics,2012,49(9):750-752.

[3]Tomos P,Lachanas E,Agathos EA,etal.Pulmonary aspergillosis in chronic leflunomide treatment[J].Surg Infect(Larchmt),2012,13(4):282-283.

[4]Brod SA,Hood ZM.Ingested (oral) SST inhibits EAE[J].Autoimmunity,2011,44(5):437-443.

[5]Lee SW,Park HJ,Kim BK,etal.Leflunomide increases the risk of silent liver fibrosis in patients with rheumatoid arthritis receiving methotrexate[J].Arthritis Res Ther,2012,14(5):R232.

[6]Ma X,Jiang Y,Wu A,etal.Berberine attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis in C57 BL/6 mice[J].PLoS One,2010,5(10):e13489.

[7]Munari CC,Furtado RA,Santiago ML,etal.Inhibitory effects of Baccharis dracunculifolia on 1,2-dimethylhidrazine-induced genotoxicity and preneoplastic lesions in rat colon[J].Eur J Cancer Prev，2014,23(4):240-245.

[8]Jaini R,Altuntas CZ,Loya MG,etal.Disruption of estrous cycle homeostasis in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis[J].J Neuroimmunol，2015,279:71-74.

[9]Becker H,Stuifbergen A,Morrison J.Promising New Approaches to Assess Cognitive Functioning in People with Multiple Sclerosis[J].Int J MS care,2012,14(2):71-76.

[10]Begg DJ,De Silva K,Carter N,etal.Does a Th1 over Th2 dominancy really exist in the early stages of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis infections?[J].Immunobiology,2011,216(7):840-846.

[11]Chen P,Zhang Z,Chen Q,etal.Expression of Th1 and Th2 cytokine-associated transcription factors,T-bet and GATA-3,in the eutopic endometrium of women with endometriosis[J].Acta Histochem,2012,114(8):779-784.

[12]Matejuk A,Dwyer J,Ito A,etal.Effects of cytokine deficiency on chemokine expression in CNS of mice with EAE[J].J Neurosci Res,2002,67(5):680-688.

[13]Gregory GD,Raju SS,Winandy S,etal.Mast cell IL-4 expression is regulated by Ikaros and influences encephalitogenic Th1 responses in EAE[J].J Clin Invest,2006,116(5):1327-1336.

[14]Kelly KA,Whitacre CC.Oral tolerance in EAE:reversal of tolerance by T helper cell cytokines[J].J Neuroimmunol,1996,66(1/2):77-84.

[15]Lukic ML,Mensah-Brown E,Galadari S,etal.Lack of apoptosis of infiltrating cells as the mechanism of high susceptibility to EAE in DA rats[J].Dev Immunol,2001,8(3/4):193-200.

Effect of Leflunomide on the Balance of Th1/Th2 in Experimental Allergic Encephalomyelitis MiceYUANZheng-zhou1a,LIZuo-xiao1a,LIJing-lun1a,YANGBo1b,LINYang1b,LILan2.(1a.DepartmentofNeurology,1b.DepartmentofInterventionalRadiology,AffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzhou646000,China; 2.NursingSchoolofLuzhouMedicalCollege,Luzhou646000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of leflunomide(LEF) on experimental allergic encephalomyelitis(EAE) mice and the possible immunological mechanisms.MethodsTotal of 36 female C57BL/6 mice were randomly divided into large and small doses of LEF treatment group and the EAE control group,n=12.Myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55 was used to build EAE model.From three days before the beginning of the control group and modeling large and small doses of LEF treatment group were fed saline,LEF 8 mg/(kg·d),LEF 2 mg/(kg·d) for 10 days.Incidence and peripheral blood interleukin 4 (IL-4),interferon γ(INF-γ) levels and ratios in the mice were observed.ResultsCompared with the control group,each LEF treatment group mice had mild clinical symptoms,and peripheral blood IL-4,IL-4/INF-γ values increased(P<0.01),INF-γ levels significantly reduced(P<0.01),and compared with the small doses LEF treatment group,high dose reduction was more significant.ConclusionLEF has preventive effect on EAE,and the effect is dose dependent.Its prevention and treatment may be associated with regulation of the balance of Th1/Th2,and Th0 differentiation into Th1 drift.

Key words:Experimental allergic encephalomyelitis; Multiple sclerosis; Leflunomide; Th1/Th2 balance

收稿日期：2014-07-17修回日期：2015-02-07编辑：伊姗

基金项目：泸州市科技计划项目[2013-R-51(8/18)]

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.17.048

中图分类号：R744.51

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)17-3201-03