红景天苷对原代培养脂肪变性大鼠肝细胞细胞色素P4502E1蛋白表达的抑制作用*

田 丽，尹 玲，关莉莉，戴 宁

非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种无过量饮酒史、以肝实质细胞脂肪变性和脂肪堆积为特征的临床病理综合征。随病程的进展，其疾病谱包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化甚至肝细胞癌。NAFLD与肥胖、胰岛素抵抗、高血压以及高脂血症密切相关，并被认为是代谢综合征在肝脏的表现[1，2]。近年来，由于我国国民生活水平的快速提高、生活方式的巨大转变，NAFLD的发病率呈现快速增长的态势，在经济发达城市，NAFLD在一般人群中的发病率已达15%～30%[3]。因此，积极探索NAFLD的综合防治措施具有十分重要的意义。我们前期的研究结果表明，藏药红景天的主要药理成分红景天苷（Salidroside，SDS）能有效抑制高脂高胆固醇饮食诱导的NAFLD大鼠肝组织氧应激[4]。本研究进一步从细胞水平研究了SDS对原代培养大鼠肝细胞脂肪变性的防治机理，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物、药品与试剂 清洁级雄性SD大鼠10只，体质量150～180 g，由本校实验动物中心提供。SDS粉剂由陕西森弗高科实业有限公司提供（纯度﹥98%），D-Hanks液、DMEM高糖培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；二甲亚砜（DMSO）购自上海生工公司；I型和Ⅳ型胶原酶、台盼蓝染料、棕榈酸（Palmitic acid，PA）购自美国Sigma公司；鼠尾胶原蛋白I型购自杭州生友生物公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液由碧云天公司提供；兔抗鼠细胞色素 P4502E1（Cytochrome P4502E1，CYP2E1）多克隆抗体购自Abcam公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG购自上海康成生物工程有限公司；ECL化学发光试剂盒购自美国Pierce公司。

1.2 大鼠肝细胞的分离与原代培养 给予3%戊巴比妥钠（0.2 ml/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，在超净台内打开腹腔，游离门静脉，使用18 G留置针穿刺插入门静脉，固定，灌注37℃预热的D-Hanks液，待肝脏充分膨胀后，立即剪断下腔静脉，继续灌注直至肝脏变为土黄色，改为灌注37℃预热的含0.05%Ⅳ型胶原酶的DMEM溶液20 min。完整分离全部肝脏，剪碎肝组织，置于预冷（4℃）的含胶原酶的DMEM溶液中消化10 min，以100目不锈钢滤网过滤，获得细胞悬液，离心收集细胞（4℃，500 r/m，2 min，重复 3次），PBS清洗2次，台盼蓝染色检测细胞活率，倒置显微镜下观察细胞形态，调整细胞数至2×106／ml，接种于鼠尾胶原蛋白I型包被过的培养皿（60 mm），以含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液于37℃、5%C02培养箱内培养6 h，更换培养液，洗去未贴壁细胞，此后每24 h更换一次培养液。选取培养48 h的大鼠原代肝细胞，更换新鲜培养液，将一定数量的肝细胞接种于24孔培养板，100μl培养液/孔，待细胞完全贴壁后分3组：正常对照组（未添加任何实验药物）、0.25 mmol/L棕榈酸模型组、0.25 mmol/L棕榈酸+红景天苷组（终浓度150μg/ml，加药与造模同步进行），每组设4个复孔，培养24 h。

1.3 检测方法 取细胞上清液，采用全自动生化检测仪检测ALT和AST水平；采用ELISA法测定丙二醛（MDA）含量（南京建成生物工程研究所）；收集细胞，加入RIPA裂解液裂解细胞，3000 r/m离心，取上清，以BCA蛋白浓度试剂盒检测蛋白含量；按照试剂盒说明书操作测定甘油三酯（TG）含量（南京建成生物工程研究所提供）。

1.4 细胞内脂滴检测 收集细胞，PBS清洗3次，4%甲醛溶液固定30 min，油红O（南京建成生物工程研究所）避光染色30 min，PBS清洗30 s，光镜下观察。

1.5 细胞CYP2E1蛋白表达的检测 采用Western blot法，收集细胞，以RIPA细胞裂解液、抽提细胞总蛋白，取蛋白样品50μg行SDS凝胶电泳，以湿法电转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭2 h，加入抗CYP2E1（1：1000） 4℃孵育过夜，室温复温 30 min，TBS清洗 2次，加入 HRP标记的二抗（1：5000），室温孵育1 h，TBS漂洗，GAPDH为内参，将膜用化学发光试剂孵育1 min，于X光胶片上曝光，常规显影、定影。

1.6 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以（）表示，组间比较采用多重方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原代培养大鼠肝细胞产量及形态变化 采用改良原位两步灌流法及多次低速离心分离原代大鼠肝细胞，每只大鼠可以获得1.50×108～1.80×108个肝细胞。经台盼蓝染色示肝细胞存活率＞90%。倒置显微镜下观察肝细胞，在培养4 h，肝细胞基本贴壁，细胞呈卵圆形，胞体变大变平，呈散在分布，可见双核或单核肝细胞；24 h后见肝细胞形状变得不规则，有向外延伸的趋势，胞体明显增大平展，相邻的细胞开始建立连接；48 h后见肝细胞呈不规则多角形，相邻肝细胞相互连接更加紧密，形成条索状或岛状结构，见图1。

图1 培养48 h原代大鼠肝细胞（200×）

图2 培养肝细胞内脂滴沉积的变化（油红O染色，100×）

2.2 各组肝细胞脂滴沉积的变化 在光镜下，油红O染色30 min显示，正常对照组肝细胞内可见极少量脂滴沉积；PA模型组肝细胞内可见大量脂滴沉积；红景天苷干预组可见肝细胞内脂滴沉积明显减少，见图2。

2.3 培养上清ALT、AST、TG和MDA含量的变化 结果显示，与正常对照组比，PA诱导的脂肪变性肝细胞培养上清ALT、AST、TG和MDA含量均显著升高；与模型组比，红景天苷（150μg/ml）处理细胞培养上清ALT、AST、TG和MDA含量明显降低，见表1。

表1 3组细胞培养上清ALT、AST、TG和MDA含量（，n=4）的变化

表1 3组细胞培养上清ALT、AST、TG和MDA含量（，n=4）的变化

与正常组比，①P＜0.05；与模型组比，②P＜0.05

ALT（U/L） AST（U/L） TG（μg/mg protein） MDA（nmol/m l）正常组 11.1±1.3 3.5±0.4 55.4±12.3 1.3±0.1模型组 13.5±1.2① 5.9±0.7① 268.3±25.8① 4.2±0.9①红景天苷 11.3±1.0② 3.7±0.5② 105.7±16.8② 1.7±0.2②

2.4 肝细胞CYP2E1蛋白表达的变化 结果显示，脂肪变性的肝细胞CYP2E1蛋白表达上调，而红景天苷（150μg/ml）处理细胞CYP2E1蛋白表达水平显著下调，见图3。

图3 各组细胞CYP2E1蛋白表达的变化 经Western blot法检测发现，红景天苷处理肝细胞蛋白表达下调

3 讨论

肝脏是体内脂质代谢的主要场所，肝内脂质过度或异常沉积是NAFLD的重要病理特征[5，6]。游离脂肪酸作为NAFLD发展中一个早期且至关重要的因素，与NAFLD的发病机制有密切的关系[7，8]。棕榈酸是分布最广的饱和脂肪酸。研究表明，棕榈酸可以诱导大鼠和小鼠原代培养肝细胞出现脂肪变性，同时肝细胞分泌炎性因子如IL-8和炎性小体增加[9，10]。我们在以0.25 mmol/L棕榈酸诱导大鼠原代培养肝细胞出现脂肪变的同时，发现反映肝细胞受损的指标ALT、AST水平和脂质过氧化产物MAD含量均明显升高，而红景天苷则可逆转肝细胞脂肪变性，使受损的肝细胞得到某种恢复。

NAFLD的发病过程经历“二次打击”过程。胰岛素抵抗（IR）是NAFLD发病的首次打击，也是始动中心环节[11～13]，由于IR，胰岛素抑制脂肪酶活性下降，外周脂肪组织分解增多，导致血中游离脂肪酸（FFA）生成过多；其次，内脏型肥胖也增加了脂肪的分解速率，同样使FFA的生成增加；高脂饮食摄入的增多也可增加FFA的生成。大量的FFA通过门静脉系统进入肝脏，使肝细胞摄入过多的FFA，FFA或者经过线粒体β氧化或者经过甘油酯化而形成甘油三酯，导致肝细胞中的中性脂质堆积[14]。脂肪肝的形成降低肝细胞的解毒功能，使肝细胞对额外打击（如活性氧自由基等）的敏感性上升，更易产生严重的肝组织损伤。第二次打击则以氧化应激／脂质过氧化损伤为中心，导致单纯性脂肪肝进一步发展为脂肪性肝炎、肝纤维化甚至肝硬化[15，17]。其中，肝细胞色素P450系统是NAFLD肝细胞产生氧应激的一个重要来源。肝细胞色素P450系统是位于胞浆滑面内质网上的一组混合功能氧化酶系，与进入体内的外源性的物质代谢有关，人类确定的P450系统有20多种，其中CYP2E1是细胞色素P450系统的主要成分，从解毒功能的角度来看，CYP2E1比其它同工酶更为重要。给予CYP2E1基因缺失型小鼠高脂饮食，不但肝组织脂肪变明显减轻，而且肝组织也没有出现脂肪性肝炎的病理学改变[18]。CYP2E1转基因脂肪肝小鼠肝内CYP2E1过表达与肝损伤有密切的相关性，肝脂质过氧化标记物MDA和蛋白质氧化的标记物蛋白羰基含量相应升高，而抗氧化物如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物还原酶（GPx）活性则下降[19]。抑制肝组织CYP2E1表达，则能相应地减轻脂肪肝程度[20]。

我们的研究结果表明，红景天苷能抑制肝细胞CYP2E1的表达，同时肝细胞氧化应激水平下降，这或许是其防治NAFLD肝细胞脂肪变的主要机制之一。

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