CD47和钙网织蛋白在紫杉醇诱导的乳腺癌细胞凋亡中的表达

陈琪枫,方晓明,姜朝晖,姚宁,方旭东

(解放军第一一七医院普外科,杭州 310013)

·基础研究·

CD47和钙网织蛋白在紫杉醇诱导的乳腺癌细胞凋亡中的表达

陈琪枫,方晓明,姜朝晖,姚宁,方旭东

(解放军第一一七医院普外科,杭州 310013)

[摘要]目的探讨CD47、钙网织蛋白(CRT)在乳腺癌细胞凋亡过程中表达的变化和意义。方法用不同浓度的紫杉醇(0.1、1.0、10.0、100.0 μmol/L)作用于MDA-MB-231细胞。在不同的处理时间点(24、48、72、96 h)，噻唑蓝比色法(MTT)检测细胞抑制率变化，流式细胞术测定CD47、CRT的表达。结果MDA-MB-231细胞的生长抑制率和紫杉醇浓度呈一定的剂量、时间相关性。各处理组在培养24 h时CD47的表达均显著高于对照组，其中10.0 μmol/L组表达高于1.0 μmol/L组(F=34.71,P<0.05)；各处理组在培养48 h时CD47的表达均显著高于对照组，其中10.0 μmol/L组表达高于1.0 μmol/L组和0.1 μmol/L组(F=24.272,P<0.05)；1.0 μmol/L组在培养72 h时CD47的表达高于对照组和10.0 μmol/L组(F=3.713,P1=0.023,P2=0.02, P<0.05)；0.1 μmol/L组在培养96 h时CD47的表达高于对照组、1.0 μmol/L组和10.0 μmol/L组(F=5449,P1=0.022, P2=0.009, P3=0.008)。各处理组在培养24 h时CRT的表达均显著高于对照组，其中0.1 μmol/L组和1.0 μmol/L组的表达又高于10.0 μmol/L组(F=48.007,P<0.05)；各处理组在培养48 h时CRT的表达均显著高于对照组，其中0.1 μmol/L组和1.0 μmol/L组的表达又高于10.0 μmol/L组(F=98.683,P<0.05)。结论CD47和CRT随着乳腺癌细胞发生凋亡其表达相应增加，和细胞抑制率存在一定的相关性。

[关键词]乳腺肿瘤；CD47；钙结合蛋白质类；紫杉酚；细胞凋亡

The Expression of CD47 and calreticulin in the breast cancer cells apoptosis induced by paclitaxelChenQifeng,FangXiaoming,JiangChaohui,YaoNing,FangXudong(DepartmentofGeneralSurgery,117thHospitalofPLA,Hangzhou310013,China)Correspondingauthor:FangXiaoming,Email:fxm117@163.com

[Abstract]ObjectiveTo investigate the CD47 and calreticulin(CRT) expression in the apoptosis of breast cancer cells.MethodsBreast cancer cell line MDA-MB-231 was treated with paclitaxel at the dose of 0.1,1.0,10.0 and 100.0 μmol/L.The inhibitory effect was detected by MTT method at the four time points( 24,48,72 and 96 hours),and the CD47 and CRT expression were measured by flow cytometry.ResultsThe inhibitory rates of MDA-MB-231 cells was correlative with Taxol dose.Compared with those in the control group,the CD47 expression in the treatment groups was significantly increased at 24 hour,and in the 10.0 μmol/L treatment group,itwas higher than that in the 1.0 μmol/L treatment group(F=34.71,P<0.05).Compared with those in the control group,the CD47 expression in all treatment groups was significantly elevated at 48 hour,and 10.0 μmol/L treatment group was more higher than 1.0 μmol/L and 0.1 μmol/L treatment groups(F=24.272,P<0.05).The CD47 expression in the 1.0 μmol/L treatment group was more higher than that in the control group and the10.0 μmol/L treatment group at 72 hours(F=3.713,P1=0.023,P2=0.02,P<0.05).The CD47 expression in the 0.1 μmol/L treatment group was more higher than that in the control group,1.0 μmol/L and 10.0 μmol/L treatment groups at 96 hours(F=5449,P1=0.022,P2=0.009,P2=0.008,P<0.05).Compared with those in the control group,the CRT expression in all treatment groups was significantly elevated at 24 hour,and in the 0.1 μmol/L and 1.0 μmol/L treatment groups,it were higher than that in the10.0 μmol/L treatment group(F=48.007,P<0.05).Compared with those in the control group,the CRT expression in all treatment groups was significantly elevated at 48 hour,and in the 0.1 μmol/L and 1.0 μmol/L treatment groups,itwere higher than that in the10.0 μmol/L treatment group(F=98.683,P<0.05).ConclusionsThe expression of CD47 and CRT are increased in the apoptosis of breast cancer cells,which are correlated with inhibitory rates of MDA-MB-231 cells.

[Key words]Breast neoplasms;CD47;Calcium-Binding Proteins;Paclitaxel;Apoptosis

目前乳腺癌已成为了中国女性最常见的癌症，每年中国乳腺癌新发数量和死亡数量分别约占全世界的 12.2% 和9.6%[1]。虽然乳腺癌的综合治疗特别是生物治疗方兴未艾，而如何诱导乳腺癌细胞发生凋亡一直是我们研究的重点和热点。美国斯坦福大学研究发现许多癌细胞都表达钙网织蛋白(CRT)，CRT可招募巨噬细胞吞噬和破坏这些癌细胞，而大多数癌细胞不会受到巨噬细胞攻击，原因是因为这些癌细胞同时还表达另外一种分子CD47，能抵消了CRT信号[2]。此次我们通过诱导乳腺癌细胞发生凋亡来观察CD47和CRT表达的变化，为下一步研究通过CD47-CRT途径来影响乳腺癌细胞凋亡的可能。

1材料和方法

1.1细胞培养及分组人乳腺癌细胞系MDA-MB-231，购自中国科学院细胞生物所。常规培养于5%CO2、37℃、95%湿度恒温孵箱。培养基DMEM含10%胎牛血清、0.01 mg/mL胰岛素，添加抗生素(100 u/mL青霉素,100 μg/mL链霉素)。实验所用细胞均处于对数生长期，实验过程中设复孔常规用台盼蓝染色法检测细胞死亡率。各组细胞死亡率均≤5%。处理组：不同浓度的紫杉醇孵育，对照组：不加药物。

1.2MTT法测定细胞生长抑制率在48孔板中接种MCF-7细胞(2×104/孔)，置37℃, 5%CO2培养箱孵化过夜。细胞分为紫杉醇处理组(0.1、1、10、100μmol/L)和对照组，在培养的第24、48、72、96 h，加入 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2(MTT)20 μg(5 mg/mL)，培养4 h，再加入二甲基亚砜(DMSO) 100μL。溶解后用每联检测仪(波长A490 nm)测吸光度(OD)值，绘制生长曲线图，计算生长抑制率。生长抑制率(%)=对照组OD值-处理组OD值/对照组OD值×100%。

1.3流式细胞仪CD47、CRT分子测定同1.2步骤处理，将紫杉醇处理组(0.1、1、10 μmol/L)和对照组细胞送检。细胞经0.25%胰蛋白酶-0.03%乙二胺四乙酸(EDTA)消化制成单细胞悬液，充分吹打后1 000 r/min离心5 min；加入1 mL 磷酸盐缓冲液(PBS)液洗涤2次，加入FITC-CD47、PE-CRT单克隆抗体各5 μL，振荡器均匀，室温避光静置30 min，加入1 mL PBS液洗涤，再加入300 μL PBS液后即用流式细胞仪(BD,美国)测定细胞分子平均荧光强度。FITC-CD47和PE-CRT抗人单克隆抗体购自美国LifeSpan BioSciences公司。每次实验检测时均设立同型抗体阴性对照管。每个时间点设3个复孔,同一条件下实验重复3次测定。

1.4统计学处理数据采用SPSS17.0统计软件包进行重复测量方差分析和多元方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1MTT法检测细胞抑制率结果随着紫杉醇浓度和时间的增加，MDA-MB-231细胞的生长抑制率逐渐增加，呈现一定的剂量、时间依赖性(表1)。其24 h、48 h、72 h和96 h的半数药物抑制浓度(IC50)分别为9.033 μmol/L、2.855 μmol/L、0.831 μmol/L和1.761 μmol/L。

2.2MDA-MB-231细胞CD47、CRT表达的变化各处理组在培养24 h时CD47的表达均显著高于对照组，其中10 μmol/L组表达高于1.0 μmol/L组(F=34.71,P<0.05)；各处理组在培养48 h时CD47的表达均显著高于对照组，其中10 μmol/L组表达高于1.0 μmol/L组和0.1 μmol/L组(F=24.272,P<0.05)；1.0 μmol/L组在培养72 h时CD47的表达高于对照组和10 μmol/L组(F=3.713,P1=0.023,P2=0.02)；0.1 μmol/L组在培养96 h时CD47的表达高于对照组、1.0 μmol/L组和10 μmol/L组(F=5449,P1=0.022,P2=0.009,P3=0.008)，见表2。

各处理组在培养24 h时CRT的表达均显著高于对照组，其中0.1 μmol/L组和1.0 μmol/L组的表达又高于10 μmol/L组(F=48.007,P<0.05)；各处理组在培养48 h时CRT的表达均显著高于对照组，其中0.1 μmol/L组和1.0 μmol/L组的表达又高于10 μmol/L组(F=98.683,P<0.05)；各处理组在培养72 h和96 h时CRT的表达与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

3讨论

CD47又称整合素相关蛋白(IAP)，是一种广泛表达于机体细胞的免疫球蛋白超家族成员[3]。CD47通过其内源性配体TSP-1和SIRP-α，参与肿瘤细胞的凋亡、增值、粘附、迁移以及肿瘤相关血管的生成，在维持实体肿瘤微环境稳定中起着重要作用，可避免肿瘤细胞被吞噬[4]。目前发现CD47在多种肿瘤中高表达，认为可作为一种诊断的分子标记物和预后指标[5-6]。尤其令人感兴趣的是，封闭CD47的抗体可以诱导肿瘤细胞凋亡，在多种肿瘤的治疗研究中有效[7]。而近来干扰CD47和SIRP-α信号通路也成为了一个肿瘤治疗的研究点[8-9]。CD47在乳腺癌中研究不多，研究发现骨髓中高表达CD47的乳腺癌患者生存率明显降低，是不良预后的独立因素，且和骨髓中SIRP-α的表达高度一致[10]。近来Baccelli等研究发现基底细胞样型乳腺癌中CD47单独表达或和酪氨酸激酶受体MET的共同表达与腋窝淋巴结转移、总生存率呈负相关[11]。本研究课题中，我们发现随着乳腺癌细胞的凋亡，CD47表达相应增高，可能基于肿瘤细胞的免疫逃逸反应，避免被吞噬死亡。

表1　不同浓度紫杉醇在不同时间点的MDA-MB-231细胞抑制率

表2　MDA-MB-231细胞CD47分子平均荧光强度

注：同一时间点与对照组比较，aP<0.05；各处理组之间比较，bP<0.05;每个时间点设3个复孔

表3　MDA-MB-231细胞CRT分子平均荧光强度

注：同一时间点与对照组比较，aP<0.05；各处理组之间比较，bP<0.05；每个时间点设3个复孔

而CRT是高度保守、普遍存在于哺乳动物细胞中的钙结合蛋白，主要位于内质网腔中，具有调节细胞凋亡、应激、心血管反应等多种生理和病理生理过程的多功能蛋白[12]。目前已发现CRT在多种恶性肿瘤中的表达增加，且和淋巴结转移、肿瘤分期等呈正相关[13]。研究表明细胞发生凋亡时，膜表面CRT 分子增多、聚集成簇，形成凋亡细胞的“吞噬我”信号(Eat me signal)被吞噬细胞表面清道夫受体? LDL 受体相关蛋白(LRP)识别，启动吞噬、清除凋亡细胞的过程[14]。而Gameiro等[15]最近的研究更是发现放疗使得肿瘤细胞表达CRT，易于被杀伤性T淋巴细胞消灭。我们的研究发现化疗药物紫杉醇诱导乳腺癌细胞凋亡过程中CRT表达也增高，存在类似的杀伤机制。

目前国内外对乳腺癌细胞CD47和CRT的联合研究尚未进行过，我们对诱导凋亡的乳腺癌细胞CD47和CRT表达变化的检测，显示在凋亡中乳腺癌细胞的表达相比于对照组有明显增高。故CD47和CRT在乳腺癌细胞的凋亡和免疫逃逸中扮演重要角色，该结论对通过干扰CD47和CRT途径来治疗乳腺癌提供了一定的理论依据。

参考文献

[1]Fan L,Strasser-Weippl,K,Li JJ,et al.Breast cancer in China[J].Lancet Oncol,2014,15(7):e279-e289.

[2]Chao MP,Jaiswal S,Weissman-Tsukamoto R,et al.Calreticulin is the dominant pro-phagocytic signal on multiple human cancers and iscounterbalanced by CD47[J].Sci Transl Med,2010,2(63):63ra94.

[3]苏国宏，赵玉磊.CD47在恶性血液病中的作用[J].中国实验血液学杂志,2013,21(6):1631-1634.

[4]Barclay AN, Van den Berg TK.The interaction between signal regulatory protein alpha (SIRPα) and CD47:structure,function,and therapeutic target[J].Annu Rev Immunol,2014,32(1):25-50.

[5]Willingham SB,Volkmer JP,Gentles AJ,et al.The CD47-signal regulatory protein alpha(SIRPa)interaction is a therapeutic target for human solid tumors[J].Proc Natl Acad Sci,2012,109(17):6662-6667.

[6]Suzuki S,Yokobori T,Tanaka N et al.CD47 expression regulated by the miR-133a tumor suppressor is a novel prognostic marker inesophageal squamous cell carcinoma[J].Oncol Rep,2012,28(2):465-472.

[7]Soto-Pantoja DR,Stein EV,Rogers NM et al.Therapeutic opportunities for targeting the ubiquitous cell surface receptor CD47[J].Expert Opin Ther Targets,2013,17(1):89-103.

[8]Willingham SB,Volkmer JP,Gentles AJ,et al.The CD47-signal regulatory protein alpha(SIRPa)interaction is a therapeutic target for humansolid tumors[J].Proc Natl Acad Sci USA,2012,109(17):6662-6667.

[9]Murata Y,Kotani T,Ohnishi H,et al.The CD47-SIRPα signalling system:its physiological roles and therapeutic application[J].J Biochem,2014.[Epub ahead of print].

[10] Nagahara M,Mimori K,Kataoka A,et al.Correlated expression of CD47 and SIRPA in bone marrow and in peripheral blood predictsrecurrence in breast cancer patients[J].Clin Cancer Res,2010,16(18):4625-4635.

[11] Baccelli I,Stenzinger A,Vogel V,et al.Co-expression of MET and CD47 is a novel prognosticator for survival of luminal breast cancer patients[J].Oncotarget,2014,5(18):8147-8160.

[12] Raghavan M,Wijeyesakere SJ,Peters LR,et al.Calreticulin in the immune system:in ogressions and outs[J].Trends Immunol,2013,34(1):13-21.

[13] Sheng W,Chen C,Dong M,et al.Overexpression of calreticulin contributes to the development and prof pancreatic cancer[J].J Cell Physiol,2014,229(7):887-897.

[14] Gold LI,Eggleton P,Sweetwyne MT,et al.Calreticulin:non-endoplasmic reticulum functions in physiology and disease[J].FASEB J,2010,24(3):665-683.

[15] Gameiro SR,Jammeh ML,Wattenberg MM,et al.Radiation-induced immunogenic modulation of tumor enhances antigen processing and calreticulin exposure,resulting in enhanced T-cell killing[J].Oncotarget,2014,5(2):403-416.

(收稿日期:2014-12-20)

通信作者:方晓明，博士，主任医师，Emai:fxm117@163.com

作者简介:陈琪枫,博士,主治医师,Email:chenqifeng76@163.com

基金项目:杭州市卫生科技计划面上项目(2012B056)

中图分类号：R737.9

文献标识码：A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2015.02.022